利用DNA连接酶把载体DNA和要克隆的目的DNA片段连接在一起，成为一个完整的重组分子，这就是分子克隆中常说的连接反应。当载体DNA和外源DNA末端都是由一种产生粘性末端的内切酶切割产生的话（同尾酶也可以），或者两者末端被接上一段互补的多聚体的尾巴，那么经退火后可形成新的重组分子。连接后产生的重组分子中仍然保留着外源DNA两端的限制性内切酶切点，从而使我们能方便地从重组分子再次取出所克隆的DNA段。

DNA片段的连接在基因操作过程中应用广泛。通常情况下利用T4DNALigase必须经过长达16小时才能完成连接反应,而且反应常常受到DNA末端结构等的影响。宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)的DNA连接系统(TaKaRaDNALigationKitVer.2)由于其独特的反应液体系,可以将反应时间缩短至半个小时,且不受DNA结构等的影响,大大地节省了反应时间,方便了实验操作。此外,在使用本试剂盒时,由于只需简单地向DNA溶液中加入一种溶液,可以在极小的反应体积下,短时间内高效地完成各种形式的DNA连接。并且反应液可以直接用于感受态细胞的转化和体外包装等。

1、试剂盒内容(50次量)

SolutionI(酶溶液)250μl×3;SolutionⅡ(缓冲液)750μl×1。

2、向pUC118-EcoRI分解物中插入DNA片段(环状DNA的连接)

含有pUC118/EcoRIFragment(50ng)及1.5KbpEcoRIFragment(2.5～250ngg)的DNA溶液共5μl，加入等量的SolutionI溶液(5μl)，混合均匀后在16℃下反应30分钟，取反应液的一部分转化至JM109感受态细胞后在含有X-Gal、IPTG及Amp的L-琼脂平板培养基上涂板生长，形成单菌落，计数白色菌落。同时以通常使用T4DNALigase(350U)，在16℃下进行16小时的连接反应作对照。在本实验中所使用的JM109感受态细胞的转化效率为6.3×107Colonies/μgpUC18DNA。结果表明,使用DNALigationKitVer.2时的连接效率比使用T4DNALigase时的连接效率高。

3、向噬菌体臂λgt11/EcoRI中插入pBR322/EcoRI分解物(线形DNA的连接)

含噬菌体臂λgt11/EcoRI(脱磷酸化)250ng及pBR322/EcoRI25ng的DNA溶液共5μl,加入与DNA等量的SolutionⅡ(5μl),均匀混合。然后加入DNA溶液2倍量的SolutionI(10μl)，在26℃下反应10分钟。取20μl反应液中的4μl,使用λDNAinVitroPackingKit进行体外包装,形成噬菌体粒子，并以此感染EcoliY1090(r-)形成透明噬菌斑。同时以T4DNALigase(350U),在26℃的连接反应作对照。结果同样表明,使用DNALigationKitVer.2时的连接效率比使用T4DNALigase时的连接效率高。