丙酮酸羧化酶（pyruvate carboxylase）存在于线粒体中，是催化下列不可逆反应的酶。

丙酮酸羧化酶EC6．4．1．1．丙酮酸+CO2+ATP+H2O→草酰乙酸+ADP+Pi，ΔGo′=-0.5kcal．广泛存在于动物、霉菌和酵母中，但在植物体和大部分细菌中却不含此酶。在三羧酸循环中，它是供给草酰乙酸的主要补充反应。为一种变构酶，有乙酰CoA时，其活性存在，同时含有生物素作为和CO2反应的酶的辅酶。分子量约65万，有很多亚基。最适pH为4.8。

从小牛肝脏分离出来的丙酮酸羧化酶分子量为655 000，并含有锰(Ⅱ)和镁(Ⅱ)离子，但比例并不恒定，说明两种金属离子在酶分子中可以互相替代。由老鼠肝脏、火鸡和鸡肝脏得到的丙酮酸羧化酶只含锰(Ⅱ)离子，但如果在鸡的饮食中缺乏锰元素时，则可得到只含镁的酶。丙酮酸羧化酶需要生物素和乙酰辅酶A作为它的辅酶。丙酮酸羧化酶可以催化二氧化碳固定在丙酮酸上，生成草酰乙酸。