2. 以T7启动子作为体外转录启动子,在启动子后面靶位序列连续带有3个G,转录效率最 高;
3. 纯化质粒:(尽量避免
RNase污染) ① 加等体积的
Tris-
苯酚:
氯仿(1:1)到100μL限制
内切酶消化体系,
涡旋振荡20s, 13000g离心5min; ②上清转移,加入2倍体积
无水乙醇和1/10体积的3M的
醋酸钠(pH5.2),-20℃放置不少于2h或过夜放置; ③DNA质粒13000g离心5min ,并且用20μL H2O重悬,放于-20℃。
5. 在37℃-42℃下放置2小时。
6. 转录产物可通过1%非变性
琼脂糖来检测:取产物1μL,160V电压,结果应为两条带, 上为DNA模板,下为
RNA 产物。
注意: 1.
模板DNA(
环状或
线型):必须具有T7
启动子位点。同时,模板应为RNase-free级。在 质粒提取过程中如使用了RNase,必须通过苯酚·氯仿处理等方法除去RNase。