测定原理是利用样品各种氨基酸组分的结构不同、酸碱性、极性及分子大小不同,在阳离子交换柱上将它们分离,采用不同pH值离子浓度的缓冲液将各氨基酸组分依次洗脱下来,再逐个以另一流路的
茚三酮试剂混合,然后共同流至螺旋反应管中,于一定温度下(通常为115~120℃)进行
显色反应,形成在570nm有最大吸收的蓝紫色产物。其中的
羟脯氨酸与
茚三酮反应生成黄色产物,其最大吸收在440nm。
指标信息: 分辨率:THR-Ser Ile-leu ≥98%
保留时间重现性:RSD≤0.5% (水解,所有峰)
峰面积重现性:RSD≤1% (
水解,所有峰)
经过处理后的样品上柱进行分析。上柱的样品量根据所用
自动分析仪的灵敏度来确定。一般为每种氨基酸0.1μmol 左右(水解样品干重为0.3mg 左右)。测定必须在pH5~5.5、100℃下进行,反应进行时间为10~15min,生成的紫色物质在570nm 波长下进行比色测定。而生成的黄色化合物在440nm 波长下进行比色测定。做一个氨基酸全分析一般只需1h 左右,同时可将几十个样品一起装入仪器,自动按序分析,最后自动计算给出精确的数据。仪器精确度在±1~3%。用阳离子交换柱分离及测定氨基酸所的如图1
带有
数据处理机的仪器,各种氨基酸的定量结果能自动打印出来,否则,可用尺子测量峰高或用峰高乘以半峰宽确定
峰面积进而计算出氨基酸的精确含量。另外,根据峰出现的时间可以确定氨基酸的种类。
①
显色反应用的
茚三酮试剂,随着时间推移发色率会降低,故在较长时间测样过程中应随时采用已知浓度的氨基酸
标准溶液上柱测定以检验其变化情况。
② 近年出现的采用
反相色谱原理制造的
氨基酸分析仪,可使
蛋白质水解出的17 种氨基酸在12min 内完成分离,且具有灵敏度高(最小检出量可达1pmol)、重现性好以及一机多用等优点。
各种饲料
必需氨基酸的含量和它们之间的比例必须恰当,测定原料和产品中的氨基酸含量,以达到保证质量的目的。