分子生物学的历史开始于1930年代，“分子生物学”一词最早是由洛克斐勒基金会的瓦伦·韦弗于1938年创造，意指一个以物理学及化学来解释生命的概念。此概念的可行性，来自1910年代孟德尔遗传学的重新见世，以及1920年代原子论及量子力学的成熟。

分子生物学的历史开始于1930年代，统合了当时多种学门，包括生物化学、遗传学、微生物学与病毒学，目的是要从更基本的层次来理解生命现象。许多的化学家与物理学家，皆专注于后来成为分子生物学领域的相关研究，他们试图从巨分子的性质，来解释这些性质所衍生出来的生命现象，且尤其关注于两种主要的巨分子，第一种是核酸，例如组成基因的DNA；第二种则是蛋白质，是活跃于生物体中的活性剂。分子生物学研究，主要就是对于此两种巨分子的结构、机能以及关系的描绘。

有许多研究者关注于生物学、化学以及物理学之间的交叉，例如后来将焦点转移到生物学的尼尔斯·玻耳以及埃尔温·薛定谔。此外，从1930年代到1940年代之间，胶体化学、生物物理学以及放射生物学、晶体学等学门也渐趋成熟。

1940年，乔治·毕多与爱德华·塔特姆证明了基因与蛋白质之间的关系，因此而联系了生物化学与遗传学。他们所建立的模式生物粉色面包霉菌（Neurospora crassa），成了后来的分子生物学发展主题。1944年，纽约洛克斐勒研究院的奥斯瓦尔德·埃弗里，证明基因是由DNA所组成。阿弗雷德·赫希与玛莎·蔡斯更于1952年确认了噬菌体的遗传物质为DNA。1953年，詹姆斯·沃森与佛朗西斯·克里克基于罗莎琳·富兰克林及莫里斯·威尔金斯的研究，发现了DNA双螺旋结构。

到了1961年，方斯华·贾克柏与贾克·莫诺，提出了一个学说，认为DNA与蛋白质之间具有一种称为mRNA的中介物。于1961年到1965年间，DNA所储藏的遗传讯息与蛋白质的关系逐渐明朗，研究发现遗传密码决定了DNA的核苷酸与蛋白质的氨基酸序列之间的关联性。1960年代初期，贾克柏与莫诺阐明了某些蛋白质调节转录作用的机制。之后的10多年则开始出现许多分子生物学的应用，如遗传工程等。