单细胞分离法是一种从待分离的材料中直接分离单个细胞进行培养获得纯培养的方法。该法在显微镜下操作，对于体积较大的微生物，可以用毛细管提取微生物个体；对较小的细胞或孢子，可以用显微针、钩、环等挑取以获得单细胞；也可将适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下选取只含有一个细胞的液滴培养。

稀释法有一个重要缺点，它只能分离出混杂微生物群体中数量占优势的种类，而在自然界，很多微生物在混杂群体中都是少数。这时，可以采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养，称为单细胞(或单孢子)分离法。单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小成反比，较大的微生物如藻类、原生动物较容易，个体很小的细菌则较难。

对于较大的微生物，可采用毛细管提取单个个体，并在大量的灭菌培养基中转移清洗几次，除去较小微生物的污染。这项操作可在低倍显微镜，如解剖显微镜下进行。

对于个体相对较小的微生物，需采用显微操作仪，在显微镜下进行。市场上有售的显微操作仪种类很多，一般是通过机械、空气或油压传动装置来减小手的动作幅度，在显微镜下用毛细管或显微针、钩、环等挑取单个微生物细胞或孢子以获得纯培养。

在没有显微操作仪时，也可采用一些变通的方法在显微镜下进行单细胞分离，例如，将经适当稀释后的样品制备成小液滴在显微镜下观察，选取只含一个细胞的液滴进行培养以获得纯培养。单细胞分离法对操作技术有比较高的要求，多限于高度专业化的科学研究中采用。