多连体
多连体
若干个结构相同的单体,按同一方向首尾相连构成的一个DNA长分子,即是一个线状多连体。λ噬菌体在其生长周期的某一阶段,能以“滚环”方式复制出很长的线性多连体。在基因重组过程中,λ噬菌体DNA基因复制的过程等都会形成DNA的多连体。
简介
若干个结构相同的单体,按同一方向首尾相连构成的一个DNA长分子,即是一个线状多连体。λ噬菌体
多连体DNA,在粘性质粒或λ噬菌体中构建的重组体,进行体外包装反应时,在高浓度的DNA及连接酶条件下所形成的多连体。
λ噬菌体DNA的复制形成多连体
在λ噬菌体感染的早期,环形的λ DNA分子按θ形式从双向进行复制,其复制的起点是位于cⅡ基因和O基因之间,并且需要O和P这两个基因编码的蛋白质分子的积极参与。到了感染的晚期,控制滚环复制机理的开关被启动了,合成出了由一系列线性排列的λ基因组DNA组成的长多连体分子。滚环复制机理的开关是受λ噬菌体gam基因产物控制的,它可以抑制大肠杆菌核酸外切酶V对复制中的DNA分子的作用(这种酶是由大肠杆菌recB和recC基因编码的,所以又叫做RecBC酶)。因此,在RecBC-的寄主细胞中,gam-的噬菌体只能产生出多连体的DNA分子。因为在噬菌体颗粒的包装成熟过程中,需要由λ噬菌体基因组DNA组成的多体分子参加;而在RecBC-寄主细胞中,gam-噬菌体只能产生出λ噬菌体基因组DNA的单体分子。因此在这种情况下,噬菌体颗粒成熟之前就要发生单体分子之间的重组作用。这种重组作用,是由噬菌体的red基因产物,或是寄主细胞的recA基因产物的作用所引起的。但无论是重组作用形成的,还是由滚环复制产生的λ噬菌体基因组DNA的多连体分子,都必须经过核酸酶的切割作用,从cos位点处将它分离成单位长度的单体分子之后,才能够被包装起来。已知有四种头部蛋白质参与了这种切割过程。
分子克隆过程中产生的DNA多连体
DNA分子与载体分子连接是克隆过程中的重要环节之一。
连接的方法有:
(1)粘性末端连接
DNA片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端,用同一种限制性内切酶消化DNA可产生相同的粘性末端。在连接酶的作用下可恢复原样,有些限制性内切酶虽然识别不同顺序,却能产生相同末端。
(2)平头末端连接
用物理方法制备的DNA往往是平头末端,有些酶也可产生平头末端。平头DNA片段可在某些DNA连接酶作用下连接起来,但连接效率不如粘性末端高。
(3)同聚寡核苷酸末端连接。
(4)人工接头分子连接
在平头DNA片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性内切酶识别位点的寡核苷酸片段,经限制性内切酶作用后,就会产生粘性末端。
连接反应需注意载体DNA与DNA片段的比率。以λ或Cos质粒为载体时,形成线性多连体DNA分子,载体与DNA片段的比率高些为佳。以质粒为载体时,形成环状分子,比率常为1:1。
目的基因与克隆载体的体外重组形成多连体
DNA体外重组是将目的基因(外源DNA片段)用DNA连接酶在体外连接到合适的载体DNA上,这种重新组合的DNA称为重组DNA
DNA体外重组技术,主要是依赖于限制酶和DNA连接酶的作用。在选择外源DNA同载体分子连接反应的程序时,一般需要考虑下列三个因素:①实验步骤要尽可能简单易行;②连接形成的接点序列,应能被某种限制酶重新切割,以便回收插入的外源DNA片段;③对转录和转译过程中密码结构的阅读应不发生干扰。
在连接反应中,正确地调整载体DNA和外源DNA之间的比例,是获得高产量的重组体转化子的一个重要因素。如果是使用质粒分子作为克隆的载体,其重组体分子是由一个载体分子和一个目的DNA片段连接环化而成的,故当载体DNA与目的DNA的比值为1时,便有利于这类重组体分子的形成;若是应用λ噬菌体或黏粒做载体时,配制高比值的载体DNA/给体DNA的连接反应体系,则有利于重组体分子的形成。以黏粒载体为例,因为只有当给体DNA片段的两个末端都同黏粒载体结合之后,才能被有效地包装。在体外连接反应中,DNA的总浓度对形成什么样的DNA分子类型同样也会有所影响。一般规律是,低浓度的DNA分子问的相互作用机会少,有利于环化作用;而高浓度的DNA,则有利于形成长的多连体DNA分子。此外,连接反应的温度也是影响连接效果的另一个重要因素。
参考资料
最新修订时间:2023-04-23 17:57
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概述
简介
λ噬菌体DNA的复制形成多连体
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