山本寺氏为越后守护上杉氏的分支，定长之父为山本寺定景，其母则据说乃长尾能景之女，因此就家名来说，定长是上杉同族，就姻戚来说，定长是谦信的姨丈。永禄二年（1559年），
上杉谦信上洛去觐见了幕府将军足利义辉，获得“上杉七免许”，以及继承山内上杉氏家名、关东管领职务的许可。十月下旬，回到春日山城中，越后众臣纷纷前来，献上太刀以为恭贺，就此留下了一份重要文件——《侍众御太刀之次第》。文件名既为“次第”，可见是对于群臣献礼顺序之安排，首批献礼的是所谓“直太刀之众”，只有三位，即古志的十郎殿（上杉景信）、山本寺殿（山本寺定长）和桃井殿（桃井孝义），此三人的身份最为高贵！
参与谦信的直刀派（同族派）活动。充任谦信的养子
上杉景虎的监护人，跟随谦信转战各地，立下不少军功.特别是弘治元年(1555年)的
川中岛合战，负责进攻武田军的本阵。并于御馆之乱时助景虎征战，后战败而四处流浪。天正3年(1575年)的【上杉御军役帐】中，山本寺定长位列上杉一门众第五位的待遇。天正6年(1578年)的
御馆之乱中站在景虎一方，战败后逃亡了。