探针技术，利用能特异性识别或标记目标分子并适合直接检测的化学物质(探针)进行检测分析的化学和生物学技术。

探针属于高效分析试剂，其最大特点在于专一性强、灵敏度高。探针技术在生物大分子研究、药物分析、司法鉴定、临床疾病诊断和治疗等方面发挥着巨大的作用。基于核酸分子杂交原理的核酸探针是最常见的一类探针，另外还有金属离子探针和有机小分子探针等。

核酸探针　

利用核酸分子杂交的特性对特定核酸序列进行检测。将杂交链中的一条用某种可检测的物质进行标记制成探针，可实现对另一条互补链的识别和检测。由于核酸探针与互补链之间的识别作用是通过数十乃至成百上千个位点间的氢键结合力和碱基专一配对作用实现的，因此具有极高的特异性。核酸探针的来源和种类　核酸探针主要有DNA(脱氧核糖核酸)探针、RNA(核糖核酸)探针、cDNA(互补DNA)探针和寡聚核苷酸探针等。前三种核酸探针一般通过分子克隆获得，因此称为克隆探针。寡聚核苷酸探针是人工合成的碱基数较少的DNA片段，属于短链探针。寡聚核苷酸探针的最大优点在于对靶序列变异的识别能力较强，因为短探针中碱基错配会导致杂交体的融链温度显著下降，而克隆探针对于单个或少数碱基不配的两个序列往往杂交信号相当，难以区分。此外，寡聚核苷酸探针还具有杂交时间短、可一次大量合成和成本低廉等优点。不过，克隆探针的特异性通常比寡聚核苷酸探针强，因为后者序列较短，随机遇到互补序列的可能性要大。另外克隆探针可标记的位点比寡聚核苷酸探针多，因此可获得较强的杂交信号，即灵敏度较高。核酸探针的标记　最早采用的标记方法是放射性同位素标记法，常用的放射性同位素有32P、3H和35S等。放射性同位素标记探针灵敏度较高，但由于半衰期限制，标记后存放时间有限，另外对操作者和环境有放射性危害，因而越来越多地被非放射性标记技术所取代。非放射性标记试剂种类丰富，如金属、荧光染料、地高辛半抗原、生物素和酶等，通过酶促反应、光促反应或化学修饰等方法标记到核酸分子上。常用的核酸探针标记方法有缺口平移法、末端标记法、随机引物法和聚合酶链式反应法(PCR)等。

核酸探针的检测技术　

主要有：

①传统印迹杂交法。将参加反应的一条核酸链固定在固体支持物（如硝酸纤维素滤膜、微孔板）上，另一条反应核酸链游离在溶液中的检测方法称为固相杂交法。传统的印迹杂交技术是典型的固相杂交检测法，是将存在于凝胶中的生物大分子转移（印迹）到固定化介质上后进行检测分析的技术。转移的方法有毛细法、电转移法和真空吸引转移法等。

②实时荧光PCR技术。将荧光标记探针与PCR扩增反应相结合建立的检测方法。其理论基础是荧光共振能量转移（FRET）原理，即当两个荧光基团靠近时，高能量荧光基团会将受激发后产生的能量转移到相邻的低能量荧光基团上。根据标记在探针上的两种荧光基团所发出荧光信号的变化可以测定PCR扩增产物的数量变化，从而使得荧光PCR技术可以达到实时检测的目的。TaqMan技术和LightCycler技术都是典型的实时荧光PCR检测技术。TaqMan技术是利用Taq酶的5′外切酶活性，合成一个能与PCR产物杂交的探针。探针的5′端和3′端分别标记不同的荧光基团，其中3′端的荧光基团能够吸收5′端荧光基团发出的荧光。这样在正常情况下只能检测到3′端荧光基团的荧光信号，而5′端荧光基团发出的荧光是检测不到的。当溶液中含有目标PCR产物时，探针与产物杂交，激活Taq酶的5′外切酶活性，将探针5′端连接的荧光基团从探针上切割下来，从而发出荧光。切割的荧光基团数与PCR产物的数量成比例。因此根据PCR反应液的荧光强度即可算出初始目标产物的数量。此法标记成本较高，尚未达到普及应用阶段。另外，本底较高，酶的性能对定量也有一定影响。LightCycler技术是将荧光基团和猝灭基团分别标记在可与目标物同一条链上相邻序列杂交的两个不同的探针上，其中荧光基团连接在发光探针的5′端，猝灭基团连接在猝灭探针的3′端。当两探针与目标链杂交时，荧光基团和猝灭基团由于相互靠近发生FRET而使荧光猝灭。荧光猝灭的程度与目标链的起始量成正比，以此可以进行PCR定量分析。该方法的特点是猝灭效率高，但由于两个探针结合于模板上，对扩增效率造成一定影响，另外由于需要合成两个较长的探针，因此成本相对较高。总的来说，实时荧光PCR比普通PCR省时，定量线性范围也宽得多，并且减少了扩增产物受污染的可能性。

③分子信标技术。是将荧光基团和猝灭基团分别标记在同一探针的5′末端和3′末端，自身形成一个发卡结构。正常情况下，荧光基团和淬灭基团邻近，不会产生荧光。当探针在溶液中遇到目标链发生杂交反应时，探针的发卡结构被破坏，溶液便产生荧光。荧光的强度与溶液中目标物的量成正比，因此可用于核酸的定量分析。分子信标结合不同荧光标记可用于基因多突变位点同时分析。

④芯片检测技术。将核酸探针以高密度点阵的形式固定在小型的硅片、玻璃片或尼龙膜等表面上，与样品中的同源核酸分子杂交，然后采用激光共聚焦显微镜或电荷耦合检测器图像处理等技术进行检测，这种阵列式探针检测技术即所谓的DNA芯片技术。DNA芯片主要包括cDNA芯片和寡聚核苷酸芯片。探针微点阵的合成可采用离片合成法，即先制备好单个探针，然后按一定的顺序固定在经过特殊处理的固相载体表面。

另一种合成方法是原位合成法，即采用特制的多通道自动加样系统，直接在活化好的固相载体表面合成众多的寡聚核苷酸探针。此法合成的寡聚核苷酸芯片具有快速、高效、探针密度高等优点，借助激光共聚焦显微扫描技术可以对杂交信号进行实时、灵敏、准确的检测和分析。探针的固相原位合成技术是基因芯片从实验室走向工业化的关键，也是实现高通量、自动化分析检测的一项重大飞跃。蛋白质芯片是将抗体或抗原分子探针固定在合适的固相载体上，构成蛋白质微阵列，通过特异性的免疫反应来检测目标物。

有机小分子探针　

包括：染料探针　

有机荧光染料分子除了可作为有色基团共价标记到核酸链上构成核酸探针外，还有一些可以通过嵌入、沟区或静电作用等结合方式与核酸分子相作用，实现对核酸的检测。重要的染料探针有菲啶和吖啶类、吲哚和咪唑类及碳菁阳离子染料等。溴乙锭、吖啶橙及其二聚物等属于菲啶和吖啶类荧光探针，主要作为嵌入剂与DNA结合，染料分子中的菲啶环和吖啶环为生色团或荧光团。苯酚基双(苯并咪唑)和苯乙氧基双(苯并咪唑)、4,6–二脒基–2–苯基吲哚、4,6–(二咪唑啉–2)–2–苯基吲哚等是典型的吲哚和咪唑类染料。它们的膜渗透性较好，并且选择性地结合A(腺嘌呤)–T(胸腺嘧啶)碱基对，可用于活细胞染色、细胞周期研究等。

碳菁阳离子染料是较新的一类荧光染料探针，与DNA的作用方式有嵌入型、缔合型和共价键型等，结合产物的荧光强度大大增强，而遇其他的生物大分子几乎不染色。碳菁阳离子染料根据所含芳香环分为苯并噻唑、苯并胚唑、吲哚和苯并咪唑类等。噻唑橙和胚唑橙二聚体，称为TOTO系列染料(又称菁染料对称二聚体)，是核酸染色最灵敏和亲和力最强的荧光探针，利用光成像和流式细胞光度法可检测由它们标记的单个核酸分子。蛋白质荧光探针也是一类染料，当吸附或共价结合到蛋白质上时荧光特性会发生变化，从而可以研究蛋白质的结构和测定蛋白质。已报道的蛋白质荧光探针有血管状黄素、吖啶橙和四磺酸基酞菁–Al(Ⅲ)等。

荧光钙探针　

胞液内游离Ca2+浓度的测定和调控对认识各类细胞的生理活性具有重大意义，以EGTA〔乙二醇–双(2–氨基乙醚)四乙酸〕为选择性螯合剂合成的一系列荧光钙探针试剂在无损伤测定单细胞内游离Ca2+浓度方面发挥了重要作用。荧光钙螯合剂探针是在原有基础上进行了酯化修饰后的产物，酯基团使探针分子的脂溶性明显增加，可轻松透过细胞膜，然后在细胞内酯酶的作用下水解转化成对Ca2+敏感的羧酸形式，实现对Ca2+的选择性检测。用激光共聚焦显微镜可以观察细胞内不同部位Ca2＋浓度的变化情况。光散射染料探针　大多为三苯甲烷类，如溴酚蓝、铬天青、铝试剂和四碘酚磺酞等，均属于非联苯型三苯甲烷试剂；溴连苯三酚红、茜素紫和茜素菁绿等属于联苯型染料。一些水溶性卟啉试剂和偶氮类试剂也具有光散射染料探针的性质。这类探针的共同特点是含有带电荷的亲水性基团，如酚羟基、羧基或磺酸基及不带电的疏水基团，与蛋白质之间以非共价键形式结合，根据光散射信号的增加可实现对蛋白质的测定。另外还可用来测定金属和核酸。

大环化合物探针　

一些大环化合物如冠醚、大环多胺和杯芳烃等以金属离子–配体和金属离子结合位点组装等作用方式，对某些有重要生理意义的阳离子表现出高选择性识别能力，可作为相应金属活性阳离子的检测探针。

离子探针　

利用过渡金属离子作为离子探针，可通过光谱和波谱手段检测某些重要生物大分子中所含金属离子所处的构象、价态、环境和对称性等性质，探明其在生命过程中的重要功能。离子探针的关键在于替换生物分子中原金属离子后，仍能保持生物大分子的基本活性，并具有特征的检测信号。离子探针既包括游离（水合离子）形式，也可以是络离子形式。根据检测信息的特征则可分为紫外–可见吸收探针、磁共振探针、荧光光谱探针、圆二色谱探针和穆斯堡尔探针等。稀土荧光探针是一类重要的离子探针，三价镧系稀土离子Tb(Ⅲ)和Eu(Ⅲ)的水溶液均具有荧光，且灵敏度很高，常作为生物大分子的探针，用来研究生物大分子（如蛋白质）的构象，确定生物大分子中金属离子的结合部位及其与生色基团的距离，还可测定竞争离子与生物大分子结合的离解常数等。由于稀土荧光探针谱线窄、寿命长（稀土荧光寿命通常为10～1 000微秒，而生物样品本底荧光寿命只有1～20纳秒），非常有利于消除生物样品的背景干扰，在药物分析中得到广泛应用。金属络离子探针主要有稀土络离子荧光探针和过渡金属络离子探针。

稀土离子与有机小分子配位体形成络合物后，化学性质发生变化，络合物激发态寿命进一步增加，荧光强度也增加。常见的配位体有乙二胺四乙酸和HEDDA〔N,N–二(2–羟乙基)乙二胺–N,N–乙酸〕等氨羧类络合剂，水杨酸、联吡啶等芳香羧酸类，β–二酮类螯合剂和杯芳烃等大环配位体等。双功能螯合剂稀土络离子探针及其相应的时间分辨荧光免疫分析方法在临床检验中已得到广泛应用。常见的过渡金属络离子如Pt(Ⅱ)和Ru(Ⅱ)等可作为发光探针或荧光探针，通过嵌入方式键合到DNA或RNA分子上，称为金属嵌入剂，是一类重要的离子探针。Ru(bpy)2(dppz)2+{二(2,2′–联吡啶)–二吡啶〔3,2–a∶2′,3′–c〕并吩嗪钌}对核酸表现出优良的络离子荧光探针性能，被称为DNA分子的“光开关”。Os(Phen)2(dppz)2+{二邻菲罗啉–二吡啶〔3,2–a∶2′,3′–c〕并吩嗪锇}是在前者基础上合成的另一种DNA分子“光开关”，是唯一在红外光区发射荧光的DNA探针。某些金属离子与卟啉的络合物也能通过嵌入的方式与蛋白质和DNA相互作用，成为一类有用的金属络离子探针。

张华山,王红,赵媛媛.分子探针与检测试剂.北京:科学出版社,2002.