氧化硫硫杆菌(Thiobacillus thiooxidans,T.t)于1922年由Waksman和Joffe分离得到，具有快速氧化单质硫以及还原态的硫化物的功能。专性好氧,嗜酸,革兰氏阴性菌,棒状,大小为1×2mm,宽0.3~0.5μm，长1.0~2.0μm。氧化硫杆菌以氧化单质硫或还原态的硫化物来获得自身细胞生长和代谢所需要的能量,以NH4+为氮源,以空气中CO2为碳源。

细菌冶金是湿法冶金新的研究领域和方向,目前已在铜、铀、金的提取方面获得了成功应用。几乎所有的硫化矿都可用细菌提取其中的有价金属。且细菌冶金技术因其投资小、成本低、能耗少、工艺流程简单和对环境友好等特点,已成为21 世纪资源处理的主要工艺技术. 目前使用较多的浸矿菌种除氧化亚铁硫杆菌( Thiobacillus ferro2oxidans, T. f) 外还有氧化硫硫杆菌( Thiobacillusth iooxidans, T. t). 氧化硫硫杆菌是一种化能自养菌,专性好氧,嗜酸,革兰氏染色阴性,呈杆状,宽0. 3～0. 5μm,长1. 0～2. 0μm. 氧化硫硫杆菌以氧化单质硫或还原态的硫化物来获得自身细胞生长和代谢所需要的能量,以NH+4 为氮源,以空气中CO2 为碳源。 因为生长环境的差异,不同地域的氧化硫硫杆菌之间必然存在着差异,因此,须根据不同的浸矿要求分离不同的氧化硫硫杆菌菌株. 本文就是根据某矿浸矿的要求,去分离、纯化和培养一株氧化硫硫杆菌菌株。

1　水样采集

水样取自某矿矿坑。取样方法如下:先将用牛皮纸扎好的取样瓶与取样勺用高压灭菌器高压灭菌,在取样点打开牛皮纸,用酒精灯烧灼瓶口,舀取水样至取样瓶三分之二处,迅速扎好牛皮纸带回。

2　培养基的配制

液体培养基采用Starky - Na2 S2O3 培养基和Waksman 培养基。 固体培养基采用Starky -Na2 S2O3 - 琼脂培养基。

3　水样处理

考虑到水样的pH值在2. 5 左右,适合氧化硫硫杆菌的生长,细菌数目较多,所以将水样倍比稀释1 000倍。

4　细菌分离

取稀释后的水样10 mL加入到90 mL Starky- Na2 S2O3 培养基中,置恒温水浴摇床培养,温度设定为30℃,转速设定为200 r /min。待菌液pH值达到1. 0左右时,取5 mL菌液加入到95 mL新的培养基中。如此反复进行5次。

5　细菌纯化

在事先用紫外线灭菌的洁净操作工作台中,取10μL培养好的菌液加入到固体培养基上,再用灭菌的涂菌器将菌液涂布均匀。将培养皿正置室温2 h后转到30℃恒温培养箱中倒置培养。

6　单克隆挑选与培养

用灭菌的10 μL tip 头从培养皿表面挑取形态规则,大小适中的单个菌落转到液体培养基中,置30℃水浴摇床中培养。转速设置为200 r /min。待菌液pH值达到1. 0左右时,取5 mL菌液加入到95 mL 新的培养基中(同时接种到Starky -Na2 S2O3 培养基和Waksman培养基中)。如此反复进行5次。最后一次培养时,每天测定pH值,当pH值达到1. 0左右时用血球计数板计数细菌量。

1　细菌分离

培养时每天测定pH值,到第7天时pH值达到了1. 0. 染色后镜检发现视野下有较多行动活跃的杆菌。

2　细菌纯化

培养进行到第12天可以看到培养皿上有针尖大小的菌落,到第20天可以看到菌落直径长至1 mm左右,呈绿色。

3　克隆挑选

挑选单克隆转到液体培养基中培养,每天测pH值,其中pH值变化最快的一株菌株变化情况使用血球计数板计数,氧化硫硫杆菌的数量都达到了每毫升107 个。

关于能在矿坑水和矿体土壤中生存的细菌已有不少的报道。目前用人工合成培养基已经分离培养了许多新菌种,这些新菌种被推广和应用到生产过程中,产生了巨大的经济效益和社会效益。

用于矿物浸出的微生物多为化能自养菌,在繁殖和生长过程中,不要求任何有机物,纯粹靠无机物为能量来源。 对于某些细菌,比如氧化亚铁硫杆菌,一些有机物的存在还会抑制其生长。 这些浸矿细菌有着一些共同的特点:它们能在普通微生物所不能生存的强酸性矿坑水中生存,革兰氏染色为阴性,活动能力较强,通过直接作用和间接作用浸出矿石。

氧化硫硫杆菌作为浸矿细菌的一种,生长过程中也不需要有机物,它能通过对硫及其化合物的氧化获得生长和繁殖必须的能量。同时,在这个过程中会产生硫酸和能溶于酸性介质的金属元素,达到加快浸矿速度,减少酸耗,从而降低生产成本的作用。并且,它在对贫矿和尾矿的处理上有其独特的优势。 所以,选育生长能力强,氧化性能好的氧化硫硫杆菌具有重要的意义。

本研究中我们使用了Starky - Na2 S2O3 培养基和Waksman培养基,研究发现,氧化硫硫杆菌在使用Na2 S2O3 做能源时, pH值呈现先升高后降低的趋势,我们认为这是因为在氧化硫硫杆菌生长的初期,它在溶液中发生缓慢的歧化反应,生成亚硫酸钠和硫单质,这两者都是氧化硫硫杆菌极易利用的还原性物质。同时,硫代硫酸钠和亚硫酸钠的水解释放出OH- ,使溶液的pH缓慢上升。在经过7天的迟缓期,随着氧化硫硫杆菌进入对数生长期,才开始发挥其对硫和还原性含硫化合物的卓著的氧化作用能力而开始产生大量硫酸,使pH值大幅下降。 此过程可以用以下反应式表示:2S + 3O2 + 2H2O→2H2 SO4

而使用硫做底物时, pH值先是缓慢下降7天左右,然后开始迅速下降. 我们认为主要是培养初期细菌数量较少,当生长7天后,细菌进入对数生长期,细菌数量迅速增加,产生的硫酸相应增多,引起pH值迅速降低. 所以这两种培养基都可以用于氧化硫硫杆菌的培养,但是如果使用氧化硫硫杆菌浸矿时,由于它在Waksman培养基中生长时,没有pH值上升的过程, pH值下降更迅速,更有利于浸矿反应。