酶的催化作用是通过其与底物形成复合物（即中间产物）降低反应能阈来实现的。酶是一个大分子蛋白质，而底物往往是小分子化合物，现已证实，酶分子表面不是任何部位都能与底物相结合的。只有称为酶的活性部位才能与底物结合并进行催化作用。
酶的活性部位：有些必需基团虽然在一级结构上可能相距很远，但在形成空间结构时彼此靠近，集中在一起，形成具有一定空间结构的区域，并能与底物特异地结合，将底物转化为产物。这一区域，称为酶的活性部位（Active site）。对于缀合酶来说，辅因子上某一部分的结构，往往是活性部位的组成成分。
酶的活性部位在酶的催化机制中的作用：由于酶的活性部位与底物结合后，能使底物作用浓度相对增加，易于反应（称为邻近效应，Proximity）；或使底物功能基团受酶影响，作定向转移 （Orientation），更有利于催化作用发生；或活性部位内的催化基团提供质子或吸收质子，呈现
酸碱催化剂的作用；或形成一个以共价键相结合的活泼中间物，降低活化能；或使底物分子中某些化学键受到牵拉变形而易断裂（又称底物形变，Strain，Distortion），这些因素相互配合，使催化效率大为提高。