琼脂稀释法是最常用的纯种分离方法。先将待分离的材料作一系列的稀释（如1：10，1：100，1：1000，1：10000……），然后分别取不同稀释液少许，与已融化并冷却至45℃的琼脂培养基相混合，摇匀后倾入灭过菌培养皿中，待琼脂凝固后，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，平皿上就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能是由一个细菌繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，重复上面操作数次，便可得到纯培养。