酶切是对粘末端的DNA分子和载体分子进行切割，以获得相应的粘末端连接。酶切可以是单酶切也可以是双酶切。单酶切操作比较简单，双酶切困难。

酶切可以是单酶切也可以是双酶切。单酶切操作比较简单，但双酶切如果两种酶所用缓冲液成分不同（主要是盐离子浓度不同）或反应温度不同，这时可以采用如下措施解决：（1）先用一种酶切，然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一种酶切；（2）先进行低盐要求的酶酶切，然后添加盐离子浓度到高盐的酶反应要求，加入第二种酶进行酶切；（3）使用通用缓冲液进行双酶切。具体要根据酶的反应要求进行，尽量避免活力损失。

一、实验材料准备

1. 材料：质粒DNA。

2. 试剂：限制性内切酶、ddH2O。

3 . 仪器：微量移液枪，离心机，水浴锅， 电泳仪，紫外透射观测仪。

二、单酶切

1. 在1.5 mL灭菌离心管中依次加入：

（1）质粒DNA：X μL（约1 μg）。

（2）限制性内切酶：1 μL（约10 U）。

（3）10×buffer：2 μL。

（4）ddH2O：补足20 μL。

2. 混匀，做好标记。

3. 37℃水浴1-3 h。

4. 70℃水浴10 min中止反应。

5. 电泳检测酶切效果。

三、双酶切

1. 在1.5 mL灭菌离心管中依次加入：

（1）质粒DNA：X μL（约1 μg）。

（2）限制性内切酶1：1 μL（约10 U）。

（3）限制性内切酶2：1 μL（约10 U）

（3）10×buffer：1或2 μL。

（4）ddH2O：补足20 μL。

2. 混匀，做好标记。

3. 37℃水浴1-3 h。

4. 70℃水浴10 min中止反应。

5. 电泳检测酶切效果。

四、结果与分析

假若一种酶在环状质粒DNA中只有一个酶切位点， 且酶切彻底，紫外灯下检测电泳结果，则单酶切应为一条带， 而双酶切则为两条带。如果条带数目多于理论值，那么有可能是酶切不完全。如果酶切结果与酶切前的质粒条带一样（超螺旋、线性和开环三条带），则说明质粒完全没有被切开。