该技术是利用
限制性内切酶能识别
DNA分子的特异序列，并在特定序列处切开DNA分子，即产生限制性片段的特性，对于不同种群的生物个体而言，他们的DNA序列存在差别。如果这种差别刚好发生在内切酶的
酶切位点，并使内切酶
识别序列变成了不能识别序列或是这种差别使本来不是内切酶识别位点的DNA序列变成了内切酶识别位点。这样就导致了用限制性内切酶酶切该DNA序列时，就会少一个或多一个酶切位点，结果产生少一个或多一个的酶切片段。这样就形成了用同一种限制性内切酶切割不同个体DNA序列时，产生不同长度大小、不同数量的限制性酶切片段。后将这些片段电泳、转膜、变性，与标记过的探针进行杂交，洗膜，即可分析其多态性结果。
DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限制片段长度多态性)已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。所用的探针为来源于同种或不同种基因组DNA的克隆，位于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记(Mark)，构建分子图谱。当某个性状（基因）与某个（些）分子标记协同分离时，表明这个性状（基因）与分子标记连锁。分子标记与性状之间交换值的大小，即表示目标基因与分子标记之间的距离，从而可将基因定位于分子图谱上。分子标记克隆在质粒上，可以繁殖及保存。不同限制性内切酶切割基因组DNA后，所切的片段类型不一样，因此，限制性内切酶与分子标记组成不同组合进行研究。常用的限制性内切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子标记则有几个甚至上千个。分子标记越多，则所构建的图谱就越饱和。构建饱和图谱是RFLP研究的主要目标之一。