非竞争性抑制是指有些抑制物往往与酶的非活性部位相结合，形成抑制物一酶的络合物后会进一步再与底物结合；或是酶与底物结合成底物一一酶络合物后，其中有部分再与抑制物结合。虽然底物、抑制物和酶的结合无竞争性，但两者与酶结合所形成的中间络合物不能直接生成产物，导致了酶催化反应速率的降低，这种抑制称为非竞争性抑制。

作用：抑制剂与游离酶或酶-底物复合物结合的一种酶促反应抑制作用。酶-底物-抑制剂复合物（ESI）不能进一步释放出产物。这种抑制使得Vmax变小，但Km不变。

⑴ 非竞争性抑制剂的化学结构不一定与底物的分子结构类似；

⑵ 底物和抑制剂分别独立地与酶的不同部位相结合；

⑶ 抑制剂对酶与底物的结合无影响，故底物浓度的改变对抑制程度无影响；

⑷ 动力学参数：Km值不变，Vmax值降低。