革兰氏阴性杆菌的鉴别特征是具有一双层细胞壁，虽然所有细菌都有一细胞内膜，革兰氏阴性杆菌还有一个均一的外膜。

外膜阻止某些药物和抗生素穿入细胞。这特征说明为什么革兰氏阴性细菌一般较之革兰氏阳性细菌更耐药。 革兰氏阴性细菌的外膜富含一种称之为脂多糖的分子，如革兰氏阴性菌进入血流脂多糖能激起疾病的暴发，包括发热和血压下降，因而脂多糖常被视为一种内毒素。 革兰氏阴性细菌具有在同属的菌株中，甚至在不同属的菌株中极易发生遗传物质（DNA）的交换，这就意味着如果一种革兰氏阴性菌发生遗传变化（突变）或者获得了对某种抗生素耐药的遗传物质，这株细菌稍后可与另一株菌共有其DNA，第二株菌也就成为耐药株。