限制性内切酶识别特定的
DNA序列，除此之外，
酶蛋白还要占据
识别位点两边的若干个碱基，这些
碱基对内切酶稳定的结合到DNA
双链并发挥切割DNA作用是有很大影响的，被称为保护碱基。
在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的
基因片段两端加上特定的
酶切位点，用于后续的酶切和
连接反应。由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被
限制性核酸内切酶切开，因此在设计
PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。
添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。什么样的
酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的，见附表。
添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条
引物的
Tm值和各引物的碱基分布及
GC含量。如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。