同步化即
细胞周期同步化,意为使整个细胞群体处于细胞周期同一时相的操作。其实现方法主要分为天然同步化和人工同步化。在实际工作中,人们常将几种方法并用,以获得数量多、同步化效率高的细胞。
在自然界中已经存在一些细胞群体处于细胞周期的同一时相的例子。例如有一种黏菌(Physarum polycephalum)的变形体plasmodia,只进行
核分裂而不进行细胞质分裂,结果形成多核
原生质体结构。又如,大多数
无脊椎动物和个别
脊椎动物的早期胚胎细胞,可同步化
卵裂数次甚至十多次,形成数目可观的同步化细胞群体。
人工选择同步化是指人为地将处于周期不同时相的细胞分离开来,从而获得不同时相的细胞群体。例如,处于
对数生长期的单层培养细胞,细胞分裂活跃,大量处于
分裂期的细胞变圆,从培养瓶(皿)壁上隆起,与培养瓶(皿)壁的附着力减弱。若轻轻振荡培养瓶(皿),处于分裂期的细胞即会从瓶(皿)上脱落,悬浮到培养液中。收集培养液,通过离心,即可获得一定数量的分裂期细胞。将这些分裂期细胞重新悬浮于一定体积的培养液中培养,细胞即开始分裂,由此可以获得不同时相的细胞。
人工选择同步化的优点是,细胞未经任何药物处理和伤害,能够真实反映细胞周期状况,且细胞同步化效率较高。缺点在于单次分离的细胞数量少,要获得足够数量的细胞,成本大大高于采用其他方法。
细胞同步化可以通过人工诱导而获得,即通过药物诱导,使细胞同步化在细胞周期的某个特定时相。目前应用较广泛的诱导同步化方法主要有两种,即DNA合成阻断法和分裂中期阻断法。
DNA合成阻断法指采用低毒或无毒的DNA合成抑制剂,将细胞抑制在DNA合成期,从而实现同步化。目前采用最多的DNA合成抑制剂为TdR(
胸腺嘧啶核苷)或
羟基脲。以TdR阻断法为例:将一定剂量的TdR加入培养液,凡处于S期的细胞立刻被抑制(但可能处于S期中的任何时期),而其他各期的细胞则照常运转。培养一定时间(G2+M+G1)后,其余所有细胞则被抑制在
G1期和S期的交界处。此时细胞总体所处的时间区段仍然较宽(见“TdR阻断法”图B);为了进一步同步化,需要洗脱TdR进行培养,并且在细胞进入下一个S期前(见“TdR阻断法”图C)再次加入TdR,使所有细胞被抑制在G1/S期交界处,从而实现同步化。
分裂中期阻断法的原理如下:某些药物,如
秋水仙素、秋水酰胺和
诺考达唑等,可以抑制
微管聚合,因而能有效地抑制细胞
纺锤体的形成,将细胞阻断在细胞
分裂中期。处于间期的细胞,受药物的影响相对较弱,常可以继续运转到
M期。因而,在药物持续存在的情况下,处于M期的细胞数量会逐渐累加。通过轻微振荡,将变圆的M期细胞摇脱,经过离心,可以得到大量的分裂中期细胞。将分裂中期细胞悬浮于新鲜培养液中继续培养,它们可以继续分裂并沿细胞周期同步运转,从而获得G1期不同阶段的细胞。