实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time polymerase chain reaction）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。它结合了PCR技术和实时荧光检测技术，能够在PCR反应过程中实时监测DNA的扩增情况，从而实现对靶DNA的定量分析。

实时荧光定量PCR的基本原理是利用DNA聚合酶在PCR过程中合成新DNA链的特性，结合一种荧光标记的探针或染料，通过实时监测荧光信号的增加来测量PCR反应的进行程度。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。实时荧光定量PCR具有多项优点，包括高灵敏度、高特异性、宽线性范围、快速、自动化程度高以及对样本数量和质量要求低等。它广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因型分析、环境微生物学研究等领域。

在PCR反应开始时，两个特定引物（一对引物）与待测DNA模板序列的两端结合。这些引物是由实验人员设计的，与待测序列的特定区域互补。在实时荧光定量PCR中，还添加了一种荧光标记的探针。这个探针也与待测DNA序列的特定区域互补，并且在PCR过程中与靶DNA结合。探针上的荧光分子通常被一个猝灭器掩盖，因此荧光被猝灭。但是，当探针与目标DNA结合时，它被DNA聚合酶切割，释放出荧光分子，导致荧光信号的增强。这个荧光信号的强度与PCR反应中的目标DNA数量成正比。

将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。

Ct值（Cycle threshold，循环阈值）的含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数

1. 荧光阈值（threshold）的设定

PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省（默认）设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10*SDcycle 3-15

2. Ct值与起始模板的关系

每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，公式如下。

Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)

n为扩增反应的循环次数，X0为初始模板量，Ex为扩增效率，N为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。

起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

实时荧光定量PCR所使用的荧光物质可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：

1. TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。

2. SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR仅与双链DNA进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定PCR反应是否特异。

3. 分子信标：是一种在5和3末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，不会产生荧光。PCR产物生成后，退火过程中，分子信标中间部分与特定DNA序列配对，荧光基因与淬灭基因分离产生荧光。

1983年美国科学家Kary Mullis发明PCR方法，用于放大扩增特定的DNA片段，可看作是生物体外的特殊DNA复制。

1985年，Cetus公司从温泉中分离的嗜热菌（Thermus aquaticus）株中纯化出耐热DNA聚合酶（后面简称Taq 酶）。该酶耐高温的性质极大地提高了PCR扩增的效率，使得PCR真正变为现实，为其自动化铺平了道路。但是PCR技术也有其相应的局限性，就是对扩增产物分析时需要开盖处理，容易造成污染。为了解决这一问题Russ Higuchi进行了一系列相关研究。

1992年，Higuchi在一次报告中提出了实时荧光定量PCR技术。通过检测溴化乙锭的含量实时监控整个PCR反应的进程。之后经过不断的研究，通过对PCR反应的数学函数关系、相应的算法以及对标准品的运用，就可以对待测样品中的目标基因进行准确定量。

1996年ABI公司推出世界上第一台定量PCR仪7700型。设备由荧光定量系统和计算机组成，通过荧光染料或荧光探针，对PCR产物进行标记跟踪，结合相应的软件对结果进行分析，可以实现计算待测样品的初始模板量。由此，实时荧光PCR技术开始更广泛的应用。

传统定量PCR

1．传统定量PCR方法简介

（1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。

（2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。

（3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。

2．内标在传统定量中的作用

由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异，因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。

3．内标对定量PCR的影响

若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。

实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：

1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。

外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。

在Real-timePCR中，模板定量有两种策略，相对定量和绝对定量。

检测方法

1.SYBRGreenⅠ法：

在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

SYBR定量PCR扩增荧光曲线图

PCR产物熔解曲线图（单一峰图表明PCR扩增产物的单一性）

2.TaqMan探针法：

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。

实时荧光定量PCR仪器的核心组件之一是热循环装置，它能够控制PCR反应体系的温度变化。热循环装置通常由Peltier温度控制模块构成，能够快速、精确地调节反应体系的温度，通常包括加热和冷却功能，能够在不同的PCR反应步骤中（如变性、退火、延伸）快速切换温度，以满足PCR反应的要求。

实时荧光定量PCR仪器配备了高灵敏度的光学检测系统，用于实时监测PCR反应过程中荧光信号的变化，通常包括激光器、滤光片、光电二极管（photodiode）等部件，能够对荧光信号进行准确、稳定地检测。

实时荧光定量PCR仪器通常配备多个荧光探测通道，用于同时检测多个靶序列或多种荧光标记。每个荧光探测通道都具有特定的波长范围，用于检测不同荧光标记产生的荧光信号。

部分实时荧光定量PCR仪器具备自动化功能，能够实现样品加载、PCR反应、数据分析等过程的自动化操作。这些自动化功能能够提高实验效率，减少操作失误，特别适用于大规模样品处理和高通量实验。

各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核、性病等传染病诊断和疗效评价；地中海贫血、血友病、性别发育异常、智力低下综合症、胎儿畸形等优生优育检测；肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断；遗传基因检测实现遗传病诊断。

流感：实时荧光定量PCR被广泛用于传染病的快速检测，如流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒等呼吸道病毒的检测。对于传染病的早期诊断尤为重要，实时荧光定量PCR能够在症状出现前或出现症状的早期阶段准确地检测病原体，有助于采取及时的隔离和治疗措施。

遗传性疾病：通过对患者样本中特定基因突变的定量分析，可以帮助医生进行准确的遗传性疾病诊断和风险评估。

早期癌症诊断：通过对患者体液样本中肿瘤相关标志物的定量分析，可以实现癌症的早期筛查、疾病进展监测以及疗效评估。

耐药性检测：如耐药菌株的β-内酰胺酶、环丙沙星耐药基因等。对于耐药菌株的快速诊断和药物敏感性测试，实时荧光定量PCR能够为临床治疗方案的制定提供重要依据。

禽流感、新城疫、口蹄疫、猪瘟、沙门菌、大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、寄生虫病等、炭疽芽孢杆菌。

食源微生物、食品过敏源、转基因、乳品企业阪崎肠杆菌等检测。

医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究。

各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。

由于qPCR是实时定量检测致病病原体基因核酸，因此它比化学发光、时间分辨、蛋白芯片等免疫学方法更具独到优势。

临床样本（如血液、粪便、组织等）和环境样本中可能含有各种抑制物，如血液中的血红蛋白、免疫球蛋白，粪便中的腐殖酸等。这些抑制物可能干扰 PCR 反应，降低酶的活性，从而影响扩增效率。

样本中的抑制物还可能影响荧光信号的检测准确性。比如某些物质可能会产生非特异性荧光，干扰检测仪器对目的荧光信号的收集和分析，使定量结果出现偏差。

对于病毒等低拷贝数的样本，准确检测存在一定困难。在起始模板量极低的情况下，PCR 反应可能会受到随机因素的影响，如少量模板分子的不均匀分布、早期循环中的扩增效率波动等。这可能导致结果的重复性差，难以准确量化模板的初始浓度。例如在早期新冠病毒检测中，当患者处于感染初期，病毒载量很低时，实时荧光定量 PCR 检测可能无法及时、准确地检测出病毒，需要多次检测才能确诊。

引物和探针的设计对于检测的特异性至关重要。如果引物与非靶序列存在较高的同源性，就可能产生非特异性扩增。例如在复杂的微生物群落检测中，设计的引物可能会与多种微生物的基因序列有部分匹配，导致除目标微生物外的其他微生物也被扩增，从而干扰检测结果。

基因序列的多态性也会给引物和探针设计带来困难。不同个体或不同菌株的同一基因可能存在单核苷酸多态性（SNP）等变异，这可能导致引物和探针无法有效结合，出现假阴性结果，或者结合到非预期的位点，产生假阳性结果。

当进行多重 PCR（同时检测多个靶基因）时，不同引物和探针之间可能会发生相互作用，产生交叉反应。在检测多种病原体的多重 PCR 体系中，不同病原体的引物可能会形成引物二聚体，消耗引物和反应底物，降低对目标基因的扩增效率。

根据MIQE（Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments）的指导方针，qPCR为Quantitative real-time PCR的简称，RT-qPCR指的是Reverse transcription–qPCR，RT-PCR仅用来表示Reverse transcription polymerase chain reaction，而不是Real-time PCR，但是有少数作者并没有坚持这一原则。