寺田屋事件是指1866年3月9日（庆应二年正月二十三日），土佐藩士坂本龙马在京都斡旋萨长同盟的会谈之后在寺田屋遭暗杀未遂的事件。

1866年3月9日凌晨2时，下榻于京都伏见寺田屋的坂本龙马和长州藩士三吉慎藏被德川幕府伏见奉行林忠交麾下的30名巡捕包围，正在洗澡的坂本龙马的爱人楢崎龙（阿龙）及时注意到这个状况，裸体跑到二楼的坂本龙马住所通风报信。巡捕们在接近坂本龙马时高呼：“这是肥后守（林忠交）的命令！”坂本龙马则谎称：“我是萨摩藩士！”但巡捕们并不吃他这一套。于是坂本龙马拿出从高杉晋作那里得到的左轮手枪，与三吉慎藏一起自卫，打死巡捕两人，打伤多人，在冲突过程中，坂本龙马拿枪的手被巡捕的刀所砍，左右大拇指都受伤，便说自己不能装弹了，于是三吉慎藏用枪拼命抵抗，楢崎龙则趁机躲进后门的腌菜缸，好不容易才从后门逃出生天，一路狂奔，藏身于材木屋里。三吉慎藏打算切腹，被坂本龙马阻止，并请求他去伏见萨摩藩邸求援。萨摩藩邸的留守居役大山彦八带着3名藩士乘船去救坂本龙马，坂本龙马才得以脱离险境。他们马上向京都的西乡隆盛报告，吉井幸辅骑快马来伏见协调事情，西乡隆盛则派军医担当治疗并警护藩邸。

次日，萨摩藩邸拒绝了伏见奉行对坂本龙马的引渡要求。

对于该事件，有人说新撰组所为，但这不过是因为把伏见奉行的官位“肥后守”误认为是京都守护松平容保（松平肥后守）而联想到其管理下的新撰组而已。虽然现今都知道这是错误的说法，但还是有些书籍沿袭旧说，说是新撰组干的。根据《三吉慎藏日记抄》，他和坂本龙马在伏见每次遭新撰组盘问时都能无事通过，毫无被怀疑的迹象。伏见奉行行动的理由似乎是听说欺骗萨摩藩士的不逞浪人在寺田屋。

事后，坂本龙马先从伏见藩邸移居京都藩邸，但后来又回到伏见藩邸，并从大阪坐船去萨摩。在西乡隆盛的帮助下，他在此后一段时间内一边温泉疗养一边潜伏，并与楢崎龙正式结为连理。尽管如此，他还是没能逃过劫数，在1867年12月10日的近江屋事件中被暗杀。近江屋事件的一个参与者京都见回组成员今井信郎在明治政府审讯时供述，因为坂本龙马在寺田屋事件中杀了两人后逃走，所以他们才要暗杀坂本龙马以执行对杀人逃犯的处决，如此言如属实，则可以说寺田屋事件间接导致了坂本龙马被暗杀。