CAS号152697-45-5，分子式C15H23N2O17P2T，分子量568.31000。

闪点：26ºC

储存条件：-20ºC

危险品运输编码：UN 2910 7

危险类别码：R10

安全说明：S16

方法：提取基因组DNA作为模板，通过PCR扩增得到酶基因，经DNA体外重组构建表达质粒。结果：实现在大肠杆菌中的表达，并成功转化黄原胶菌株。转化过程提示黄原胶菌株可能具有某些特殊性。

建立了一种经济、简便的一步酶法，大量合成尿苷二磷酸葡萄糖。在酶法合成中，用UTP代替ATP，并建立了UTP的再生系统；建立了反复补加法和酶回收法，使酶的利用率达到最高。

黄原胶是由野油菜黄单胞菌（Xanthomonascampestris）分泌的胞外杂多糖，是目前产量最高的微生物多糖之一，具有假塑性、温度和pH稳定性，以及与盐类良好的相容性，广泛应用于食品、石油、化工、医药等领域。国外关于黄原胶的研究从20世纪60年代起步，国内自70年代开始，包括菌种选育、发酵工艺研究、黄原胶理化性质探讨及其免疫学活性分析等。经查阅资料发现，在黄原胶的合成过程中，含糖的底物需要尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶（uridinediphosphateglucosedehydrogenase，UDPGD）的催化才能生成葡萄糖醛酸，而后者是黄原胶生物合成的前体之一。故此，我们设想以黄原胶菌株基因组DNA为模板，通过合成引物、扩增、克隆得到UDPGD基因，在实现大肠杆菌的表达后，再转入原黄原胶菌株，希望UDPGD酶量的增加能够带来黄原胶产量增加的正效应。文献报道UDPGD基因全长1338bp，285bp处含PstⅠ切点，740bp处含BamHⅠ切点，编码445个氨基酸，蛋白相对分子质量48432。经过实验，我们对UDPGD的研究工作取得了初步结果。

1、一锅法合成UDPG

早期研究的酶法合成UDPG通常都是通过Leloir途径，从六位碳被标记的14C-葡萄糖出发，经巳糖激酶葡萄糖磷酸变位酶、UDPG焦磷酸化酶三步酶法催化，过程中需要添加腺苷三磷酸（ATP）和尿苷三磷酸（UTP）等辅底物，产率达到80%～95% 。葡萄糖-1-磷酸的生成是所有反应的限速步骤，反应平衡不利于葡萄糖-1-磷酸的生成，而添加焦磷酸酶能够迅速转移过程产生的焦磷酸，使得整个过程有效正向进行。Ma等从13C标记葡萄糖出发，利用传统Leloir途径偶联尿苷三磷酸再生系统合成UDPG，实现了UDPG的0.5g级高产，产率达到70% 。在整个过程中，添加由丙酮酸激酶参与的尿苷三磷酸再生系统来保持尿苷三磷酸浓度。之前有报道称，当UTP/Mg2+摩尔比达到1：1或1：2时，Leloir法制备UDPG产率非常低，但Ma等发现，UTP/Mg2+摩尔比1：2时，UDPG的产率仍达到85%以上，证实了高浓度Mg2+并不是Leloir法产UDPG的重要抑制因素，而 当UTP浓度高于2mmol/L时，UDPG产率显著降低，因此UTP的浓度是影响UDPG产率的重要因素。

Bae等在大肠杆菌MV1184（Escherichia coliMV1184） 中重组表达栖热菌GK24UDP糖焦磷酸化酶（Up） ，将重组酶纯化后用于转化UDPG。实 验结果表明UDPG转化率达到31.6%，产物纯化后UDPG产率达到9.7%，当以N-乙酰葡糖胺（Glc NAc） 为底物生产UDPGlc NAc时，产物纯化后产率达到41.1% 。Muthana等以普通葡萄糖-6-磷酸为底物，通过重组表达长双歧杆菌ATCC55813（Bifidobacterium longum ATCC55813）UDPG焦磷酸化酶（BLUSP） 和多杀巴斯德菌无机焦磷酸酶双酶偶合小规模产UDPG，UDPG产率高达99%，避免了使用昂贵的13C或14C葡萄糖。因此采用基因重组表达外源酶系的方法使酶来源不再受限制，给UDPG酶法合成提供了新思路。

2、两步酶法合成UDPG

Zervosen等报道了一种两步酶法合成UDPG。尿苷单磷酸（UMP） 经尿苷单磷酸激酶生成尿苷二磷酸（UDP） ，这一步伴随着ATP的去磷酸化并偶联丙酮酸激酶催化的ATP再生过程，UDP在蔗糖合酶的催化下与蔗糖发生反应生产UDPG和果糖，UDPG产率为38% 。在反应过程中，蔗糖合酶利用蔗糖糖基基团的能量直接催化蔗糖的裂解，避免使用昂贵的活化葡萄糖，Su Sy从稻米中提取获得，每千克稻米约产63U的蔗糖合酶。Rmer等在酿酒酵母22574d中表达土豆（Solanum tuberosum L．） 蔗糖合酶（Su Sy1） ，30L发酵罐中连续发酵36h，粗酶液中Su Sy1比酶活达0.3U/mg，与稻米产Su Sy相比，产率提高7倍左右。

3、糖基转移酶可逆催化合成UDPG

Ryu等发现一种新型的糖基转移酶可逆催化海藻糖制备UDPG法。来源于Pyrococcus horikoshii的海藻糖糖基转移酶（Tre T） 能够催化核苷二磷酸葡萄糖和单糖产海藻糖，普遍的观点认为这类基于核苷磷酸糖的糖基转移酶催化的反应是不可逆的。但已有报道称另一种来源于Thermococcus litoralis的海藻糖糖基转移酶能够催化可逆的反应。Ryu等也发现来源于Pyrococcus horikoshii的海藻糖糖基转移酶能够可逆地催化海藻糖和尿苷二磷酸产UDPG，并设计了一个固定化酶分批催化产UDPG的过程。

以超滤膜固定化糖基转移酶，重复19批次循环反应，平均每批产率达10%，证实了固定化海藻糖糖基转移酶能够用来批量催化产UDPG。

UDPG迄今为止，尽管有许多关于化学法和酶法制备UDPG的研究报道，但通过综合分析可以发现，利用细胞内的酶系来合成UDPG能够避免使用纯酶，受细胞壁保护的胞内酶稳定性更好，还容易实现酶的级联反应。因此，在基因工程菌中过表达UDPG合成酶系，通过控制代谢流量提高胞内UDPG的合成，胞内UDPG被直接利用作为底物偶合主反应，避免向反应体系中额外添加UDPG，降低了生产成本。胞内合成UDPG的途径涉及多个代谢途径和多条基因。利用葡萄糖从头合成UDPG会影响糖酵解途径、戊糖磷酸途径、核苷酸合成和能量代谢。

1、过表达UDPG合成途径中的关键酶

Mao等在大肠杆菌中过表达UDPG合成途径上的两个关键酶: 葡萄糖磷酸变位酶和UDPG焦磷酸化酶，使其从葡萄糖-6-磷酸节点处分向UDPG合成的碳流量比对照菌提高8倍多。但若超过一定诱导剂浓度范围，UDPG的合成量不再随酶的表达水平的提高而增加，说明尚存在其他因素是影响UDPG合成的瓶颈。Oh等在大肠杆菌中引入UDPG焦磷酸酶、UDP激酶、UDP-葡萄糖-4-变旋酶和β-1，4-半乳糖基转移酶4个酶，使重组菌的乙酰氨基乳糖合成量提高了10倍，同时其乳糖合成量也提高了2.6倍。Jesús克隆了由nis A启动子操控的干酪乳球菌BL23基因gal U，通过同源过表达，UDPG焦磷酸化酶活性提高了100倍，UDPG合成量提高了9倍。

2、异源表达UDPG合成酶系

Bosco等克隆了野油菜黄单胞菌（Xanthomonas．campestris pv． campestris）和柑橘溃疡病菌中编码UDPG-焦磷酸化酶的基因gal U，分别在两株大肠杆菌中过表达，重组菌合成UDPG的最大速率VMAX均能达到空白对照菌株的7倍左右，值得注意的是，在UDPG合成中，重组菌UDP-焦磷酸化酶比酶活达到60～90U/mg，远高于大肠杆菌（4.8U/mg）、伊乐藻属和肺炎链球菌属。