意大利医生雷地于1668年进行的实验以及其他一些科学家的反复验证，曾一度动摇了人们对自然发生论的信念。可是当后来发现了微生物时，很多科学家又相信至少像微生物这样“最小的”生物体总该是自生的。加罩容器中的腐肉不是长满了细菌吗！于是，微生物可能
自然发生的信念又盛行起来。
巴斯德根据自己的研究实践，不相信微生物可以自然发生，认为微生物肯定必有母体。他到宣传这一理论。这下子可激怒了自生论者。他们问巴斯德：“
酵母怎在地球的每一个角落里，在每一世纪的每一年里，不知道从什么地方出现，把
葡萄汁酿成酒？这些从天南地北，处处把每个罐里的牛奶变酸，每瓶里的牛油变坏的小动物，来自什么地方？”
为了回答这些挑战，巴斯德重做了
斯帕兰扎尼的实验。他在圆瓶里灌进一些
酵母汤，把瓶颈焊封，煮沸几分钟后搁置适当时间。结果表明，瓶里并没有微生物生长。
这一试验并不能彻底驳倒自生论者。他们坐在巴斯德的书房里吵吵闹闹：“你在煮沸酵母汤时，把瓶里的空气加热了。酵母汤产生小动物所需要的是自然的空气。你不能把酵母汤和天然的未经加热的空气放在一起而不产生酵母、
霉菌、杆菌或小动物！”
面对对方的指责，巴斯德冥思苦想，决心设计一种只让天然空气进入而不许其中的微生物进入的仪器。在老教授巴拉的指导下，巴斯德终于设计、制作出了符合这一要求的仪器，即著名的
曲颈瓶。实验取得了完全的成功。他喜不自胜。在一个有学者、才子、艺术家争相参加的巴黎盛会上，巴斯德讲述了他的曲颈瓶试验，高声宣布：“
自然发生学说，经过这简单实验的致命一击之后，绝不能再爬起来了”。
接着，巴斯德又创造性地做了一次大规模的、半公开的实验。他和助手们将煮过的装有细菌培养液的烧瓶分放在多尘的市区、
巴黎天文台的地窖里和其他环境中打开。发现空气越是不洁，培养液变质就越快、越严重。这说明使培养液变质的细菌不是自生的，而是来自空气。他推测，海拔越高，空气一定越洁净，培养液受细菌的污染也越轻微。为了验证这一点，他和助手们又先后登上
汝拉山区的浦佩山，爬上瑞士的
勃朗峰，进行实验。结果，猜想得到了证实。
巴斯德向科学界报告了自己的实验结果。许多听众无不为他们的冒险献身所感动，为他们的证据所折服。可是坚持
自然发生说的反对派仍继续起劲地谴责巴斯德，称他是“马戏团的演员、骗子和
小丑”。攻击得特别凶的是博物学家布歇（Pouch-et，一译浦舍）等人。他们还采用以巴斯德之矛攻巴斯德之盾的办法，在一些瓶子里灌进干草浸液而不是
酵母汤，并造成真空，赶往
比利牛斯山脉的高山玛拉得塔，登上了比
勃朗峰还要高出几英尺的山巅，打开瓶口。由于他们采用的是干草浸液，加之没有加热，结果在瓶中发现了微生物。借此，布歇攻击巴斯德是“以自己的瓶子作为对科学的最后通牒而惊世骇人”，要求在科学院作公开试验，而且说，如果他们的瓶子有一个打开之后而不立刻生长微生物的话，他们愿意承认错误。