道光三年（1823），他出生于云南永昌府保山县一个杨姓回族商人家庭，取名杨秀。10岁后过继给姨妈为嗣，改姓杜，更名为杜文秀。他自幼勤奋好学，13岁即通晓儒家典籍，14岁考中秀才，16岁补廪膳生员。
道光二十五年（1845）四月，保山汉族地主团练“香把会”勾结官府屠杀回民，制造了“保山惨案”。杜文秀以代表身份赴京上控，未获公正处理。咸丰六年（1856），官府支持临安（今建水）汉绅霸占回民银矿，屠杀回民。云南巡抚亦密令各地“聚团杀回”，遂于蒙化（今巍山）起兵，旋即攻下大理府。各地回、汉、彝、哈尼、白、傣、纳西等各族人民纷纷响应，烽烟遍及云南。同年10月，他被推举为“总统兵马大元帅”，建立起大理革命政权。提出“联回汉为一体，竖立义旗，驱除鞑虏，恢复中华，剪除贪污，出民水火”、“救民除暴”、“革命满清”等响亮口号，开始了长达10余年的反抗清王朝的革命斗争。
杜文秀的义军军纪严明，所到之处，公平交易，农工商各安其业，人心悦服。他响应太平天国的号召，实行轻赋税、重生产的政策，促进了生产的发展和社会的安定。在起义军内部，注意民族团结，大量启用各民族人才，力量不断发展壮大。全盛时期，占领云南53县，多次粉碎清军的大规模镇压。同治六年（1867）十月，组织20万大军进攻昆明，攻占楚雄等数十城。后因太平天国失败，清军调集优势兵力并采取政治分化等手段，致使东征失利。
1855年，回、汉豪绅争夺楚雄石羊银矿，发生械斗，总督恒春乘机惨杀回民。文秀在永昌回汉争讼中入狱。1856年由云州回民起义首领蔡春发营救出狱，即在云南蒙化（今
巍山）起兵，招募回彝民数千，9月16日攻克大理。10月17日被推举为大元帅，建立政权。
他一上任，就下令废除清朝年号，用甲子纪年，改用明朝衣冠，旗帜一律用白色，以与清军相区别。他又把大理都督府改为大元帅府，大理新政权宣告成立。杜文秀高举起反清大旗后，势如破竹，所向披靡，攻占了周围53座城池，半个云南在他的控制之下。他主张“三教同心，联为一体”，“三教”是佛教、伊斯兰教与彝族教。
1858年，云南巡抚
岑毓英采取分化诱降策略，使另一支回军主力
马如龙等叛变后，集中重兵镇压杜文秀。1872年，清军进攻大理，杜文秀于12月26日服毒后自赴清营，要求保全大理军民性命，被岑毓英所杀，起义失败。
著名历史学家
白寿彝先生曾这样评价他：“文秀的反清实践，可以说，体现了一项英明的行动纲领，这就是以回汉联合为基础的各族人民的联合反清。……文秀的这一纲领在中国农民运动史和中国民族关系史上，都是空前的壮举。”
“元帅府”位于
大理古城南门内。四周城墙高3米，宽2.1米，占地2万多平方米，是一座城中之城。议事厅殿上挂有杜文秀手书对联：天生英雄夺回汉朝世界，地出豪杰戳破胡儿乾坤。
杜文秀墓，位于大理下兑村。原墓建于1872年，1983年重修。墓高5.7米，为省级文物保护单位。