法医毒物分析是以分析化学尤其是现代仪器分析技术为基础，以能损害生命正常活动的毒物为对象并对其进行定性和定量判定，从而服务于国家法制建设的一门应用性学科。
毒物与中毒
中毒：生物体受到一定量的毒物作用而引起功能性和器质性改变后出现的疾病状态称为中毒（poisoning），由毒物所产生的中毒反应称为毒性作用。
毒性作用条件
（1）毒物的成分
（2）起作用的剂量 安全剂量 中毒量 致死量
中毒量：毒物引起个体中毒并出现中毒症状的剂量；造成死亡的剂量称为致死量（LD）
某一毒物能引起某种动物的群体全部死亡的最小剂量成为全数致死量（LD100）;引起半数动物死亡的剂量称为半数致死量（LD50）
（3）作用途径与方式 摄入途径 吸收和分布特性 给药的浓度和速度
（4）受作用的生物体 同生物体的种属有关
（5）个体因素 年龄性别体重健康状态身体素质以及生活习性
毒品（drug, illicit drug）
毒品是属于法学范畴的概念，它是由法律规定要受严格管制的一些药毒物。《
中华人民共和国刑法》第357条中规定，毒品是指鸦片海洛因
甲基苯丙胺（冰毒）吗啡大麻可卡因以及国家规定管制的其他能够使人形成瘾癖的
麻醉药品和精神药品。毒品定义的三要素
非法性（法律属性） 危害性 （社会属性） 成瘾性 （自然属性）
药物滥用
是指非医疗目的不正常的连续大量使用有依赖性（dependence）药物。
毒物的分类
分类原则 依据毒物的理化性质毒理作用用途以及来源进行分类
常见种类
气体毒物 CO H2S （中毒速度最快）
挥发性毒物 CN- C3HOH C2H5OH
合成药毒物 巴比妥类 吩噻嗪类 （临床药物最多）
天然药毒物 乌头类 颠茄类 （生物碱最多）
金属毒物 砷/汞/钡/铬/铊/铅 （最难排出体外）
农药鼠药 有机磷/
氨基甲酸酯毒鼠强 （中毒案例较多）
水溶性毒物 强酸/强碱/NO2-
分析方法
形态学方法 毒理学方法
免疫分析法理化分析法 仪器分析法
法医毒物分析的基本任务：是对各种检材中有关毒物进行分析鉴定，判明有无毒物何种毒物多少毒物以及毒物与事件的关系等，为澄清当事人在事件中是否负有法律责任提供依据，为涉及中毒案件提供侦破线索和证据。
法医毒物分析的特点：
（1）分析目的不确定 （验证侦查 研究）
（2）分析案件复杂（隐瞒事实 意外事故 非毒物引发的事件毒物种类 社会不良因素）
（3）检材多样且特别 （多样性 一次性 数量有限）
（4）分析方法综合 （分析的目的与检材的特性 ）
（5）肩负法律责任
法医毒物分析基本程序（详细见课本）
接受任务----取材----制定分析方案----分析---检验结果
接收任务 （掌握案情 了解取材情况核对检材）
检验过程 （制定方案处置检材分析）
检验结果（真实可靠）
检材处理
1 检材的处理主要有预处理及进一步根据毒物的类别不同进行毒物的分离。检材预处理是检材处理的第一步主要是指进行检材制备调节酸碱度，除去蛋白质及结合物解离等。
2 体外检材（Specimen in vivo）：主要是指那些未经过体内吸收分布 代谢等过程，其中毒物在形态气味酸碱性溶解度 和化合状态等方面尚全部或部分地保留其原有形状和性质的检材。吞服不久的呕吐物或洗胃液急死的胃内容物，其中尚有未被消化吸收的药毒物，也属于体外检材。
3 体内检材（Biomateral）主要指取自生物活体或尸体的检验材料，如尿血及内脏组织等。
4 检材处理：是指对检材中的待测毒物进行分离纯净化浓缩富集衍生化等处理，使检材中的毒物成为适合于各种分析方法所要求的形式。
5 预处理：1检材制备2调整酸碱度3去除蛋白质：有机溶剂沉淀法盐析法
等电点沉淀法酶解法4结合物的解离：酸碱水解法酶水解法
6 有机毒物提取方法：检材制备调节酸碱度去除蛋白质及结合物萃取（液-液萃取固相萃取
固相微萃取等）
7 结合物的解离 ：有些毒物在体内会与蛋白质或葡萄糖醛酸硫酸等形成结合物，需要通过水解的方式使结合状态的毒物释放出来以利于提取 。
（1）酸水解法：于检材中加入酸溶液并加热，可水解释放出结合状态的毒物 。
（2）酶水解法：在一定pH值及常温条件下，酶能使生物检材如组织血液中呈结合状态的毒物释放出来。
8 液-液提取法
当两种互相不混溶的溶剂共存时，溶质在这两种溶剂中分配的溶解量不同。利用这一性质将溶质从一种溶剂中转移到另一种溶剂中的过程称为液‐液萃取。 萃取或反萃取的效率主要取决于分配比。
9 固相萃取：（ solid phase extraction, SPE）又称液固提取法
是利用待检毒物与杂质在柱中固定相和洗脱液之间吸附或分配作用或不同组分分子大小等方面的差异进行分离。根据固定相填料的种类不同可分为正相固相萃取反相固相萃取离子交换固相萃取等。
10 固相萃取类型
（1）
正相固相萃取：采用极性固定相和中等极性至非极性的洗脱剂，适用于极性毒物的分离。
（2）反相固相萃取：固定相的极性小于洗脱液的极性，即采用非极性的固定相和中等极性或极性洗脱液。该系统适用于分离非极性毒物。
（3）离子交换固相萃取：离子交换固相萃取适用于分离带有电荷的毒物，根据填料及用途不同又分为阳离子交换柱和阴离子交换柱。
分析方法
定性分析
的目的是确定检材中所含毒物的性质，即检材是否为某种毒物或者其中是否含有某种毒物，通常又称之为检识或检出。检出的对象也包括毒药物在体内的代谢物。
定性分析要求选用的方法灵敏度高准确可靠。定性分析结果的准确性是毒物分析的关键。主要有分类效用和确证效用两种。
定量分析
的目的在于确定建材中某种毒物的含量，通常称之为含量测定或者简称测定。定量分析必须在定性分析的基础上进行。必须在明确待检物是什么的基础上进行才有意义。
形态学方法
毒理学方法 免疫分析法（一般常用于欲试筛查，不能作为确证方法）理化分析法 仪器分析
回收率：是指对检材进行处理后，所得到样品中待测物含量与分离净化前检材中原有待测物实际含量之比；纯度：是指经分离净化后所得试样中杂质含量的多少，杂质含量越低，纯度越高。纯度和回收率反应分离净化效能。一般分离净化步骤越多，则纯度高而回收率低。
方法专属性
方法准确性：（1）认证准确性。（2）定量测定值的准确性：准确度和精密度。
认证准确性：指检材中确实存在的，而且是应检识的毒物，必须得到认定，并且能证实确实为该物质而不是其他物质的属性。
准确度：是指测得值与真实值之间接近的程度。两者之间的差值成为误差。结果一般用相对回收率表示，回收率越接近100%表明分析方法准确度越高。
精密度：指在规定的测试条件下，同一样品，经多次反复检测多的结果之间的接近程度（离散程度）。反映了一个分析方法的可操作性。
方法灵敏性：常以检测限（LOD）或定量限（LOQ）表示。
检测限：指检材或检样中待测物能被检出的最少量或者最低浓度。
定量限：指检材中的待检毒物能够被定量测定的最低量，其测定结果应具有一定的准确度和精密度。
两者的区别在于前者属于一种限度检验效能指标，后者是一种定量分析的效能指标。检测限的结果常以相对浓度值表示。
定量分析的灵敏度是指方法的响应值对待测物含量的变化是否敏感，也即相应灵敏度。相应灵敏度反映了响应值改变量dR随着待检物含量的改变量dX增减的程度。一般而言dR/dX
的绝对值越大，分析方法就越灵敏。
仪器分析常用信号值和噪音的比之来确定检测限或定量限。一般认为信噪比为3时的样品浓度作为检测限，而信噪比为10时的样品浓度作为定量限。
9线性：指在设计的测定范围内，测试的响应值与待检物浓度直接呈正比关系的程度。检测范围：指能到达一定精密度准确度和线性，测试方法适用的高低浓度或量的区间。
10耐用性：指检测结果在分析条件出现变动时不受影响的能力。
仪器分析
仪器分析与经典方法比的优点：灵敏度高重现性和选择性好分析速度快及建材用量少。
第一节
光谱分析
1为分子吸收光谱，是一种带状光谱。
2透光率的负对数为吸光度（A）。A= -logT = -log（I/I0）=ECL
吸光系数（E）为单位吸光物质浓度和单位液层厚时的吸光度值。大小取决于物质的本质和入射光波长。不同物质对同一波长的单色光有不同的吸收系数。吸收系数越大，表明吸光物质的吸光能力越强，定量分析时一般选择吸收光系数最大的波长为测定波长。
3吸收光谱 是以波长为横坐标，以吸收度A为纵坐标所描绘的曲线。
4Lamber-Beer定律的适用条件（前提）：入射光为单色光溶液是稀溶液
5该定律适用于固体液体和气体样品
6在同一波长下，各组分吸光度具有加和性。应用：多组分测定
7吸光系数的物理意义：单位浓度单位厚度的吸光度
讨论：
E=f（组分性质，温度，溶剂，λ）
当组分性质温度和溶剂一定，E=f（λ）
不同物质在同一波长下E可能不同（选择性吸收），同一物质在不同波长下E一定不同
E↑，物质对光吸收能力↑, 定量测定灵敏度↑ → 定性定量依据
采用空白对比消除因溶剂和容器的吸收光的散射和界面反射等因素对透光率的干扰
用
紫外可见吸收光谱及特征参数进行定性鉴别时，给出的仅仅是官能团的信息，有一定的局限性。结构完全相同的化合物应有完全相同的吸收光谱，但是吸收光谱相同的化合物却不一定是同一化合物。
第二种 荧光分光光度法
1发光分析法：物质吸收能量后跃迁到激发态，激发态以辐射的形式释放能量回到低能态或基态，利用这一现象建立的分析方法。
2最常见的光致发光现象是：荧光 磷光
根据激发光波长：X射线红外紫外-可见；根据荧光物质的粒子：分子原子
3
分子荧光分析法：物质受到紫外-可见光照射（吸收辐射能）后，发射出与所吸收的光具有相同波长或更长波长的光辐射，即荧光。利用物质分子发射的荧光进行分析的方法。
（1） 测定原理不同 （2） 灵敏度高，测定下限比UVS低2-4个数量级 （3）选择性好。定性方面优于UVS （4） 用样量少，操作方便；重现性好
（5） 使用范围受到限制。但可用于生物活性物质
5检测器一般设在与激发光成直角的方向上。
6荧光强度与荧光物质的浓度场线性比例关系。但当浓度超过一定值时荧光强度反而减弱，这种现象称为自熄灭现象。
7
荧光分光光度法常用于微量甚至痕量毒物的定性定量分析。
8 （一）激发光谱：固定荧光波长，将光源的光用单色器分光，在不同波长的激发光照射下，测定荧光强度的变化，以激发光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，得到激发光谱。
（二）荧光光谱：固定激发光波长和强度，对物质分子发射的荧光进行分光，测定不同荧光波长的荧光强度，以荧光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，得到荧光（发射）光谱。
9荧光效率及荧光强度的影响因素。
发生荧光的必备条件：物质分子的吸光能力较强；物质分子的荧光效率较高。
10荧光分析仪及定性定量分析方法见课本。
第二节
1色谱法的特点:高分离效能高灵敏度高选择性分析速度快应用范围广
2色谱法的分类
按流动相的分子聚集状态分类:
按固定相的分子聚集状态分类:
GSCGLCLSCLLC等
按操作形式分类:
柱色谱法平面色谱法毛细管电泳法等
按色谱过程的分离机制分类:
3色谱过程：组分的结构和性质微小差异 与固定相作用差异 随流动相移动的速度不等 差速迁移 色谱分离。
固定相：是对被分离物质有某种作用的物质。流动相：是一种流体，以一个方向通过固定相。
试样中各组分能在色谱分离过程中被分离，是由于固定相和流动相对各组分作用不相同的缘故。
4色谱图：是由检测器输出的电信号强度对时间作图所绘制的曲线。基线：是在操作条件下，没有组分流出时的流出曲线。基线反映仪器 （主要是检测器） 的噪音随时间的变化。
色谱峰：是流出曲线上的突起部分。正常色谱峰拖尾峰和前延峰
5保留时间（retention time;tR）：是组分从进样开始到柱后该组分出现峰值浓度时所需的时间
死时间 （t0）：分配系数为零的组分，即不被固定相吸附或溶解的组分，进样开始到柱后该组分出现峰值浓度时所需的时间。
调整保留时间 ：某组分由于溶解（或被吸附）于固定相，比不溶解（或不被吸附）的组分在柱中多停留的时间。
保留体积（VR）：从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大时，所需通过色谱柱的流动相体积。
死体积（V0）：是指不与固定相作用的惰性物质通过色谱柱后出峰是所需的载气体积。
峰高（peak height；h）：组分在柱后出现浓度极大时的检测信号，即色谱峰顶至基线的距离。
峰面积（peak area；A）：色谱曲线与基线间包围的面积。
总分离效能指标
分离度（resolution；R）：又称分辨率。是相邻两色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比。
一般认为Rs＞1.5，两峰完全基线分离。
6分配色谱法：分离原理 利用被分离组分在固定相或流动相中的溶解度差别而实现分离
溶质分子在固定相中溶解度越大，或在流动相中溶解度越小，则K越大。在LLC中K主要与流动相的性质 （种类与极性） 有关；在GLC中K与固定相极性和柱温有关。
固定相 ：又称固定液（涂渍在惰性载体颗粒上的一薄层液体）；
化学键合相（通过化学反应将各种有机基团键合到载体上形成的固定相）。
流动相：
气液分配色谱法：气体，常为氢气或氮气。
液液分配色谱法：与固定相不相溶的液体。
正相液液分配色谱：流动相的极性弱于固定相的极性。
反相液液分配色谱：流动相的极性强于固定相的极性。
7
吸附色谱法：分离原理 利用被分离组分对固定相表面吸附中心吸附能力的差别而实现分离。
吸附过程是试样中组分的分子（X）与流动相分子（Y）争夺吸附剂表面活性中心的过程，即为竞争吸附过程 。
8
离子交换色谱法：利用被分离组分离子交换能力的差别而实现分离。
分为阳离子交换色谱法和阴离子交换色谱法
9
空间排阻色谱法：根据被分离组分分子的线团尺寸进行分离。也称为
分子排阻色谱法。
10理论搭板概念：把色谱柱内每达成一次分配平衡所需要的柱长称为理论搭板高度（H）。
搭板理论假设色谱柱上各个板高是等同的。若柱长为L，则理论搭板数n为：n=L/H 。
对于一定长度的色谱柱,H越小，则n越大，达成分配平衡的次数越多，则峰越窄，两个分配系数不同的组分就越容易彼此分开，柱子的分离效能也越好（柱效越高）。柱长L越长，n越大，但色谱柱太长则使分析时间加长。
第三节
薄层色谱
见课本
第四节
1气象色谱法（GC）:是以气体为流动相的色谱法，适用于分离分析有一定挥发性和热稳定性的化合物，但对难挥发热稳定性差和极性过大的毒物难以分析。用作定性指标的保留时间缺乏专属性，一般要求有已知纯物质作对照。
2分类 ：按固定相的聚集状态: GSCGLC
按分离原理： GSC属于吸附色谱，GLC属于分配色谱。
按色谱操作形式：柱色谱（分填充柱色谱毛细管柱色谱）
3特点：
–高效能：neff可达103—106
–高选择性：特别复杂试样
–高灵敏度：可以检测1011~1013g物质
–分析速度快操作简单：色谱操作及数据处理自动化
–应用广泛：气体和易挥发或可衍生化为气体
- 弱点：受试样蒸气压限制和定性困难。
4
气相色谱仪：载气系统进样系统色谱柱系统检测系统记录系统
5气液色谱固定相 对固定液的要求：在操作温度下蒸气压要低；稳定性好； 对被分离组分的选择性要高； 对试样中各组分有足够的溶解能力。
6检测器：将流动相中组分的浓度或量信号转变成电信号。
浓度型检测器：测量载气中组分浓度的变化。
热导检测器电子捕获检测器等。
质量型检测器：测量组分进入检测器的质量流速变化。火焰离子化检测器
火焰光度检测器等。
7检测器的性能指标
灵敏度（sensitivity）
–浓度型检测器Sc ：为1ml载气携带1mg的某组分通过检测器时，产生的电压，V∙ml/mg；
–质量型检测器Sm：每秒有1g的某组分被载气携带通过检测器，产生的电压或电流值，mV∙s/g或A∙s/g。
检测限（detectability；D）
–某组分的峰高恰为噪音的两倍（2N）时，单位时间内载气引入检测器中该组分的质量（g/s），或单位体积载气中所含该组分的量（mg/ml）。
D=2N/S
–检测限越小，检测器的性能越好。
8常用检测器
–热导检测器（thermal conductivity detector；TCD）（原理和注意事项）
–
氢火焰离子化检测器（hydrogen flame ionization detector；FID）（原理和注意事项）
–电子捕获检测器（electron capture detector；ECD）
- 火焰光度检测器（flame photometric detector；FPD）
–热离子化检测器（thermionic ionization detector；TID）
9分析过程一般包括：
试样前处理色谱条件选择定性方法确定定量方法学考察等
10试样前处理：衍生化法顶空法吸附管法
11色谱条件选择：
12定性鉴别：利用已知物直接对照法（利用保留值定性“由于影响保留时间的因素很多，具有相同保留时间的两个色谱峰不一定是同一化合物”用已知物增加峰高法定性双柱定性）用GC/MS联用鉴别
13定量测定：在恒定的实验条件下，峰面积（或峰高）与组分的（含）量成正比。通常用已知量对照品的色谱峰面积求出校正因子（校正因子是单位色谱峰面积所代表的组分量）。 外标法内标法
但，同一检测器对不同物质具有不同的响应灵敏度。
本节重点
固定液的分类和选择
检测器的性能指标
速率理论和实验条件的选择
定量分析方法
第五节
1HPLC：是在经典液相色谱基础上，引入了气象色谱的理论和实验技术，以高压泵输送流动相，采用高效固定相及高灵敏检测器，使分离效率和分析速度明显提高的液相色谱技术。与气象色谱相比，HPLC不受被测样品挥发性和热稳定性的限制，适用于大部分有机毒物的分析检测。HPLC中流动相的选择范围较大，可以更有效的控制和改善分离条件，提高分离效率。
2与经典
液相色谱法相比：颗粒极细（一般为10m以下）规则均匀的固定相，（键合相）传质阻抗小，柱效高，分离效率高；高压输液泵输送流动相，流速快，分析速度快；
高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。
紫外检测器最小检测限可达109g，而
荧光检测器最小检测限可达1012g。
3 与
气相色谱法相比：不受试样的挥发性和热稳定性的限制，应用范围广；可选用各种溶剂作为流动相，对分离的选择性有很大作用，选择性高；一般在室温条件下进行分离，不需要高柱温。
4基本原理：待检溶液的各组分被注入色谱柱，通过压力在固定相中移动，由于不同组分在固定相和流动相之间的作用特性，而造成差速迁移后被分离。分离后的各组分通过检测器得到不同的峰信号，通过分析比对这些信号以判断待测物所含有的物质。常使用的有液固吸附色谱法液液分配色谱法。
5主要类型：分配色谱法吸附色谱法离子交换色谱法空间排阻色谱法
6液固吸附色谱法：一般固定相为吸附剂（如硅胶），流动相为极性较小的有机溶剂构成的分离体系。不同组分与吸附剂之间的“吸附与解吸附”作用大小是其分离的基础。当被测组分一定时，硅胶的吸附作用大，则容量因子大，保留时间长；同时流动相的极性大，则解吸附作用强，保留时间缩短。
7液液分配色谱法：固定相和流动相为两种互不相容的液体构成的分离体系，不同组分在两相间的分配作用大小是其分离的基础。使用的固定相是通过化学键合反应合成的表面键合有不同有机集团的刚性颗粒，称为
化学键合固定相。分为正相色谱法负相色谱法。
8正相色谱法：固定相的极性大于流动相的极性的色谱方法，主要用于分离溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型化合物。固定相是氰基和氨基键合相
9负相色谱法：固定相的极性小于流动相的极性的色谱方法，主要用于分离溶于有机溶剂的极性及中等极性及非极性的分子型化合物。固定相是
十八烷基硅烷（ODS）键合相。
10
高效液相色谱仪：高压输液系统进样器色谱柱检测器（紫外检测器荧光检测器示差折光检测器和电化学检测器）色谱工作站。
11定性分析：色谱保留值鉴别法分离后化学鉴别法两谱联用鉴别法。
12定量检测：外标法内标法
第六节
质谱技术与方法
1
质谱分析法（MS）：是将化合物形成离子和碎片离子，按质荷比（m/z）的不同进行分离，来进行成分和结构分析的方法。所得结果用质谱图（亦称质谱，MassSpectrum）表示。
根据质谱图提供的信息可以进行有机物及无机物的定性和定量分析生物大分子的结构分析样品中各种同位素比的测定及固体表面的结构和组成分析等。
2质谱法的基本原理：质谱分析的基本过程是使样品在离子源中发生电离，生成不同质荷比的带电离子，经加速电场的作用形成离子束，进入
质量分析器，在其中再利用电场和磁场使其发生色散聚焦，获得质谱图。
质谱分析中，多种离子化技术均可使物质分子失去外层价电子形成分子离子（molecular ion，M+），分子离子中的化学键还可以继续发生某些有规律的断裂而形成不同质量的碎片离子（fragment ion）
2质谱仪包括进样系统电离系统质量分析器和检测系统。为了获得离子的良好分析，必须避免离子损失，因此凡有样品分子及离子存在和通过的地方，必须处于真空状态。在进行质谱分析时，一般过程是：通过合适的进样装置将样品引入并进行气化。气化后的样
品引入到离子源进行电离。电离后的离子经过适当的加速后进入质量分析器，按不同的m/z进行分离。然后到达检测器，产生不同的信号而进行分析。
3离子源（ion source）质谱仪中将分子转化为离子的装置称为离子源（ion source）。由于离子化所需要的能量随分子不同差异很大，因此，对于不同的分子应选择不同的离解方法。通常将能给样品较大能量生成较多碎片离子的电离方法称为硬电离方法（如电子轰击离子化，EI），而给样品较小能量碎片离子较少或不生成碎片离子的电离方法称为软电离方法。
4生物质谱中有代表性的离子源
（1）．电喷雾电离（ESI） （2）．离子喷雾电离（ISI ）
（3）．大气压化学电离（APCI） （4）．
基质辅助激光解吸电离（MALDI）
（5）．快原子轰击电离（FAB）
离子源是质谱仪的心脏，可以将离子源看作是离子化反应器，样品在其中发生一系列的特征裂解反应，反应在很短时间（10-11s）内发生，所以可以快速地获得质谱图。
5质量分析器是质谱仪的核心，它将离子源产生的离子按其质量和电荷比（质荷比m/z，m—离子的质量数，z—离子携带的电荷数）的不同﹑在空间的位置﹑时间的先后或轨道的稳定与否进行分离,以便得到按质荷比（m/z）大小顺序排列而成的质谱图。
6质量分析器（mass analyzer）的种类
1.磁质量分析器（单聚焦质量分析器,双聚焦质量分析器）2.四极质量分析器（四极杆滤质器）3.飞行时间质量分析器（TOF） 4.离子阱（Ion Trap）质量分析器
5.离子回旋共振质量分析器
其中,2﹑3﹑4是生物质谱分析中常用的质量分析器
7质谱图：纵坐标表示离子的相对丰度（以质谱中最强峰的高度为100%,并将此峰称位基峰,其余峰按与基峰的比例加以表示,又称为相对强度）;横坐标表示离子的质荷比；根据峰位（棒位）可进行定性鉴别;根据相对丰度可进行定量测定.
8质谱仪的主要性能指标：质量范围分辨率质量准确度灵敏度扫描速度等
质量范围（mass range）：是指质谱仪能够测量的离子质量范围，通常用最小和最大离
子的离子质量表示。
质量准确度（mass accuracy）：质量准确度又称质量精度，即离子质量实测值M 与理论值M0 的相对误差。
分辨率（resolution，R）：是指仪器能分离相邻两质谱峰的能力。
9重点介绍两种生物质谱分析方法（见课件）
第七节
两谱联用技术（课本+课件）
1MS/MS
2GC/MS
3LC/MS：把液相色谱技术强有力的分离能力与质谱技术有效的定性分析能力相结合，特别适合于复杂体系的分离分析，已成为蛋白质组学研究中最重要的技术平台之一。
4要实现HPLC与MS的有效的联用，必须解决以下困难问题：色谱仪与质谱仪的压力匹配问题色谱仪与质谱仪的流量匹配问题气化问题。
有机化合物
1概念 合成药毒物指那些通过人工化学合成，用于临床治疗，但如果使用不当或过量也可造成中毒甚至死亡的化合物。
种类 此类化合物非常多，常见的有：安眠镇静药 抗精神病药解热镇痛药兴奋药以及麻醉药等。
性状 纯品多为白色固体粉末，易溶于有机溶剂，分离提取以有机溶剂提取为主，属于非挥发性有机毒物或有机浸出毒物。
2安眠镇静药检验的取材：
体外检材
* 剩余的饮食物（饮料水果等）
* 现场可能装过药物的容器（杯子注射器药瓶等）
* 胃内容或洗胃液
（一般成分比较简单含量较高，利于寻找检验方向）
体内检材
* 活体材料（血尿）
* 尸体材料（胃内容血肝脑脊液等）成分较复杂，含量相对较低。定量结果利于确定死因。
3安眠镇静药检材的处理：
体外检材
成分简单，药片药粉等固体检材一般可直接用乙醇溶解或提取后检测；注射液饮料等液体检材，可适当调酸碱性后液－液萃取。
体内检材
血和肝匀浆，提取时一般需先经过沉淀蛋白。提取吩噻嗪类药物时，无机酸类沉淀蛋白剂应慎用。
苯骈二氮卓类的用药量较小，体内结合率较高，必要时可先行水解再提取。
用有机溶剂萃取时，应先调节检材的酸碱性，使被提取的药物处于游离状态。苯骈二氮杂卓类－弱酸性到弱碱性；吩噻嗪类－碱性；巴比妥类－酸性。氟西泮游离碱的水溶性较大，不宜用萃取法提取。吩噻嗪类提取时应避光。
有机提取液可通过吸附柱或反提法净化。巴比妥类不宜在碱液中久置。
血尿也可直接用固相萃取小柱提取净化。
4安眠镇静药的检测方法：
5化学法检识安眠镇静药：方法 微量颜色反应和微量结晶反应
操作 瓷反应板载玻片或试管
适用 体外检材中安眠镇静药的预试筛选和检识鉴别
除眠尔通外，绝大部分的安眠镇静药都有明显的紫外吸收光谱,对一些成分简单的体外检材,如药片注射液剩余饮食物或胃内容物和洗胃液中的药物残渣，经简单处理后即可用紫外光谱预试或筛选。
三类安眠镇静药的紫外光谱完全不同，可用于鉴别。
在定性的基础上，常用于定量。
常用于HPLC方法的检测。
7气相色谱法检验安眠镇静药：
特点
灵敏度高分离能力强。
要求被分析物易挥发对热稳定。
适用
体内成分复杂含量低的检材。
苯骈二氮卓类 部分适用。有些热稳定性差或极性太大的效果不好，如
去甲羟基安定。多数易被固定相吸附而造成拖尾或难出峰，宜选OV-1DB-!等弱极性固定液
吩噻嗪类 受热易分解，效果不好。
巴比妥类
一般选用中等极性柱，如OV-17；FID检测器。
极性较大，普通条件下峰形不佳，可通过甲基衍生化可改善峰形，并提高检测灵敏度和准确性。
8高效液相色谱法检验安眠镇静药
特点
灵敏度较高分离能力强。
应用
体内检材样品有紫外吸收的。
三类药物均可适用，特别对热稳定性差或极性大的，效果较GC 好。
三类药物均具有酸碱性，常通过在流动相中加入适量酸抑制解离或形成离子对可改善分离效果。
9
红外光谱法的应用：可反映物质结构的细微差别,可鉴别结构非常相似的化合物, 如戊巴比妥和异戊巴比妥，后者因取代基末端有同碳二甲基 ，使C- H弯曲振动的吸收峰1370cm-1分裂成1355cm-1和1378cm－1两个峰。
因受样品纯度和样品量的限制,红外在毒物分析中直接应用的机会较少,仅用于一些含量和纯度都较高的体外检材。
第一节
苯骈二氮杂卓类药物
1多为白色或黄色结晶，无臭，味苦。
弱碱性，可与强酸成盐；
奥沙西泮（
去甲羟基安定）为两性。
游离化合物的极性差异较大，一般难溶于水，易溶于有机溶剂；氟西泮（氟安定）极性较大可溶于水。
七元环在强酸强碱中加热，可水解开环。
3中毒症状和体内过程：主要毒理作用是抑制
中枢神经系统，中毒后出现嗜睡头昏乏力共济失调等症状。此类药物的毒性比巴比妥类弱，长期服用可产生依赖性，用量较大可致昏迷或呼吸循环衰竭。尸检可见明显尸斑，口唇指甲青紫，内脏淤血，肺水肿脑水肿。
4检材采取和处理（见12页）
5检测方法：显色反应沉淀反应
紫外分光光度法色谱法（薄层色谱气相色谱GC/MS
高效液相色谱）
吸附剂：硅胶G
展开剂：苯:丙酮: 28%氨水（50 : 10 : 5）
丙酮: 28%氨水（99 : 1）
叔丁醇: 1mol/L氨水（27 : 3）需
氯仿:乙醇:丙酮（8 : 1 : 1）
显色剂：
碘化铋钾（橙色）；50% 硫酸和乙醇混合液（荧光）
说明：此类药物为弱碱性，一般碱性展开剂的效果较好。
此类药物较多，单一条件很难将所有药物完全分开，需通过不同的条件分离。
第二节
1除硫喷妥为浅黄略带蒜臭外，多为白色结晶，无臭有苦味；有固定熔点，可升华；
极性中等，易溶于极性有机溶剂，微溶于水，难溶于石油醚；
二酰亚胺互变异构成烯醇式时，具弱酸性，可与
氢氧化钠等强碱成盐而熔于碱水液；
内酰亚胺结构不很稳定，在强碱性溶液中长时间放置，可开环，并放出
二氧化碳；
导眠能性质与巴比妥类的相似，在强碱液中更不稳定，很快分解。
2中毒症状和体内过程：口服或肌注后迅速为分布于全身组织，肝肾中含量较高。不同类
巴比妥类药物的毒性个体差异较大。急性中毒会出现嗜睡神志不清昏迷体温下降呼吸缓慢发绀肢体软弱深昏迷等症状。慢性中毒症状为皮疹语言不清失眠健忘
共济失调等
3检材采取：其中巴比妥和
苯巴比妥的代谢和排泄速度较慢，大剂量摄入后经数日还能从尿中检出原体药物。
4检材处理：巴比妥类药物是有代表性的酸性药物之一。为避免其在碱性溶液中水解，提取不宜在碱性溶液中放置过久。
5检材方法：（见课本课件）
展开剂：氯仿:丙酮（41）
异丙醇:氯仿:浓氨水（9 :9 :2）
显色剂：硫酸汞-0.2%
二苯卡巴腙醇液, 白色→紫堇色;
N，2，6-三氯对苯醌亚胺（ NCBI） ，蓝色；
说明： 硫喷妥易分解成戊巴比妥，故常显两个斑点。
第三节
吩噻嗪类药物
1多为油状液体或低熔点的固体；碱性较强，可与多种酸成盐；药用制剂多为其盐酸盐；游离态难溶于水，易溶于有机溶剂；盐可溶于水，也可溶于有机溶剂乙醇氯仿等；有荧光；性质不稳定，遇光氧化剂等易变色；
药物制剂多为糖衣片或注射液。
2中毒症状：大量服用造成急性中毒可出现暂时性兴奋继而嗜睡
共济失调肌肉僵直痉挛血压和体温下降呼吸缓慢瞳孔缩小最后反射消失休克窒息而死亡。
3检材的采取和处理：采取检材后应避光保存尽快检验，以避免遇光氧化分解，检材可在碱性条件下用有机溶剂萃取。检材以尿液为佳，还可采集血液胃内容物洗胃液和其他组织。
4检测方法：化学方法（FPN试剂是多种氧化剂与配合剂的混合物，是检验吩噻嗪药物的特定试剂）光谱法色谱法
5吩噻嗪类药物的光谱：此类药物吸收光谱相似，一般在250 ～ 260300～310nm范围有两个吸收带，可用于预试，但不能鉴别。
因易氧化分解，分解产物氧化亚砜有四个吸收砜，且吸收较原药长移；所测的光谱常因混合物的比例不定，难有固定光谱，不易对照；为使光谱相对固定，便于对照，可将样液先用硫酸氧化或用锌还原后再进行检测。
6薄层色谱法检验吩噻嗪类：吸附剂和展开剂
硅胶板 a.甲醇:水（7 : 3）
b.环己烷:二乙胺（9 :1）
c.苯:环己烷:二乙胺（15 :75 : 20）
碱性板 a.甲醇:氯仿（1 : 9）
b.甲醇:浓氨水（100 : 1.5）
显色剂 荧光硫酸氯化钯试剂
说明：碱性较强，常因硅胶吸附而使斑点拖尾，可通过铺碱性硅胶板或于展开剂加入适量碱来改善分离效果 。在展开剂中加入适量碱，可拉开几种药物斑点的Rf值的距离。此类药物易氧化分解，常出现多个斑点，不宜对照，可先将样品在原点氧化或分解后再行展开。
第四节
局部麻醉药
1
普鲁卡因（脂类；氨基苯甲酸酯类）
利多卡因（酰胺类；酰基苯胺衍生物）
2酯烃侧链上均有叔氮结构，显碱性，临床用药多为其盐酸盐。盐酸盐均为白色或无色结晶性粉末，可溶于水乙醇等有机溶剂。普鲁卡因结构中的酯键极易水解；利多卡因和
布比卡因结构中的酰胺键也可水解。
3中毒症状和体内过程：急速静脉注射或者大量给局部麻醉药，可导致昏睡虚脱和痉挛等中毒症状，进而引起
呼吸麻痹和心搏骤停而死亡。
普鲁卡因等酯类麻醉药进入体内迅速水解，普鲁卡因生成
对氨基苯甲酸；利多卡因等酰胺类水解慢，能更多保持药物原型。
4检测方法：（见课本）
天然药毒物
1同时具有一定毒性和药理作用的天然物质及其加工产品，统称天然药毒物
2特点：中毒原因复杂；天然物的来源和名称混乱复杂；不同药毒物的毒理作用不同且毒性差异较大；天然物质及其中草药材的化学成分复杂；化学结构和理化性质差异大；检材性状差别大。
第一节
植物类天然药毒物
一乌头
1植物：毛茛科乌头属植物。
成分：二萜类生物碱，种类和含量因品种处理等不同而异。
药用：
祛风除湿温经止痛等，用于治疗
风寒湿痹关 节疼痛半身不遂等。
药典用中药有川乌草乌雪上一支蒿附子等。
生品均为剧毒中草药管制品种。
毒性：主要由双酯型二萜生物碱的多少决定。水解产物单酯型生物碱和乌头胺毒性依次递减。
2乌头生物碱的结构：母体结构为由19个碳构成的乌头胺。
毒性大的一般是在C8和C14位上的醇基与有机酸形成的双酯型生物碱。C8接的为乙酸，C14多接苯甲酸，少数为大茴香酸。
3乌头的外观形态：大致可分为两类
（1）纺锤形或圆锥形，中部多向一侧膨大，有的稍有弯曲，如川乌（乌头根）草乌（北乌头根）。
（2）长圆锥形或长圆柱形，直径较小，质坚较脆，如雪上一支蒿。
个别品种由数个根呈链状连生，如多根乌头。
4乌头生物碱的性质和检材处理：不溶于水石油醚，溶于醇乙醚氯仿等有机溶剂。
碱性，可与酸成盐。酯键极易水解，酸碱加热均可加速水解。一般在氨碱性条件下用有机溶剂提取。不宜用Stta-Otto法提取分离。
6HPLC法检验乌头生物碱：一般采用反相抑制色谱。
C18柱 25cm×4.6mm，10μm。
·流动相常用甲醇-水-氯仿-三乙胺混合溶剂
–少量有机胺可改善色谱峰拖尾，使峰形变锐；
–少量氯仿有利于乌头生物碱与杂质峰分离。
·紫外检测。
–吸收主要来自
苯甲酰基或大茴香酰基，光谱相似，在230nm左右和270nm～300nm处有吸收峰。
–水解产物乌头胺醇类是饱和化合物，无明显紫外吸收，一般HPLC不易检测。
–水解产物苯甲酸或大茴香酸的吸收光谱与未水解物相似 ，不能单凭光谱定性。
7乌头生物碱一般含量低，且分子较大不宜气化，检测以
液相色谱法和液相色谱质谱联用法为主。
8其它植物类天然药毒物（见课件）
第二节
动物类天然药毒物
斑蝥
1来源：是芫青科昆虫，
南方大斑蝥或黄黑小斑蝥的干燥虫体。
主要成分：斑蝥素（ cantharidin ）
药用：治疗腰腿痛风湿痛疥癣恶疮等，现有用来治疗肿瘤的。
毒性：大毒。生品属国家规定的剧毒中草药管制品种。
2斑蝥形态
·绿芫青（青娘子）：与斑蝥同科不同属，有些也含斑蝥素。
·红娘子：蝉科。早年文献认为含斑蝥素，80年代有研究认为不含斑蝥素。
·青娘子和红娘子也属于剧毒中草药管制品种。
3斑蝥素的理化性质和检材处理
·无色结晶，熔点218℃，120℃开始升华；
·不溶于水，难溶于石油醚，微溶于热水乙醇乙醚，较易溶于丙酮氯仿；
·斑蝥素是斑蝥酸的内酸酐，遇碱可开环成盐而溶于水，遇酸立即闭环。
·可利用升华和开环性质进行分离净化。
4斑蝥素的理化检验
方 法 结 果
对
二甲基苯甲醛反应 紫红或樱红色 其他一些酚类吲哚类酚胺类化合 物也可显色
升华试验 无色透明短棒状或棱柱状结晶
河豚
来源：鱼豚形目鱼豚科，温带，亚热带海域。
主要成分：河豚毒素（TTX）
药用：补气，祛湿，理腰脚，去痔疾和杀虫，现代重要工具药。
毒性：自然界毒性最强
神经毒素之一，导致神经中枢和神经末梢麻痹。
·白色结晶性粉末，笼形原酸酯类化合物，两性离子形式存在。
·溶解性很局限，仅溶于酸水液和酸性乙醇，微溶于水，乙醇，乙醚，不溶于大部分有机溶剂。
·碱性和强酸条件下不稳定，酸性醇沉淀蛋白同时提取河豚毒素，也可在强酸或碱性条件下加热，使河豚素分解，后者可用有机溶剂提取。
河豚毒素的检验
·小鼠生物试验法ELISA免疫法荧光法GC法GC/MS法。
·LC/MS：直接检测最有效的方法
液相-色谱-质谱联用法
柱切换-液相-质谱连用法
毒品
重点复习（课本和课件）
杀虫剂除草剂
未讲 浏览课本课件
杀鼠剂
敌敌畏
毒物
气体毒物和挥发性毒物
气体毒物主要通过呼吸道进入体内，当吸入一定量的有毒气体时，人可在较短的时间内引起呼吸功能障碍皮肤及粘膜化学灼伤甚至死亡。
挥发性毒物：指常温常压下蒸气压较高，易变成气态分子从检材体系中挥发逸出的有毒化合物。
特点： 分子量小化学结构简单常温常压下一般为液体，能随水蒸气蒸馏。
种类： 小分子醇类（甲醇乙醇）醛类（甲醛水合氯醛）醚类（乙醚）卤代烃（四氯化碳氯仿）和苯（苯胺硝基苯苯酚）的衍生物等。氰化物因能形成挥发性较大的氢氰酸而归入此类 。
有毒气体：（也称气体毒物）指常温常压下以气体状态存在的有毒化合物。
特点: 分子小结构简单中毒途径单一 （吸入性）。
种类: 主要包括一些小分子的有机化合物和一些无机酸碱的分解产物。
4挥发性毒物和气体毒物的取材及保存
检材：常用血.某些情况下也可用玻璃体胃内容物肺等为检材。
保存 ：气体或可变成气体。
a.尽量不留空间 b.密闭 c.冷藏
送检 ：及时
常用分离方法
·扩散法： * Conway氏碟 * Widmark瓶
·驱气法和抽气法
·顶空法
蒸馏法：通过加热提高挥发性组分的蒸气压，使检材溶液沸腾，挥发性组分变成蒸气从溶液中逸出，同时将蒸气不断地引出加热装置，使之冷却加以收集后供检测用。 收集的蒸气液体称“馏液”。蒸馏法分为直接蒸馏法和水蒸气蒸馏法。适用：适用面广 。
蒸馏注意事项
蒸馏酸性或碱性毒物时，蒸馏前可先适当调节检材的酸碱性，以提高毒物的挥发性。
收集挥发性较大的酸性或碱性毒物时，可适当用酸性或碱性溶液进行收集，以减少毒物的挥发损失，如氢氰酸。
蒸馏时应防止检材爆沸或蒸干。
扩散法
方法：将检材置于一密闭容器中，以一种溶剂或
化学试剂作为吸收剂，吸收气－
液平衡时气相中的挥发性组分，然后对吸收液中的挥发性毒物或消耗剩余的试剂进行检测。
驱气法（抽气法）：将一种不影响检测的气体（如氮气空气），通过加压（驱气法）或减压（抽气法）的方式通过检材，同时将检材中的挥发性组分带出，并加以收集。如果不断地通入气体，可使检材中的挥发性组分全部得以分离。属于竭尽法。分离和检测可以同时进行。分离出的挥发性组分可通过出口处的试纸直接检测，也可以用溶剂或试剂吸收后再行检测。
顶空分析
方法 ：将检材置于一密闭系统中，保持恒温一段时间 ，当气－液两相达到平衡时，直接抽取一定体积的气相用于分析。此时，气相中挥发性组分的浓度与液相中的含量有一定的关系。顶空分析与气相色谱法联用时称顶空气相色谱法
特点 ：简便，定量比较麻烦（需加内标）。
适用 ：属于平衡法，适用于蒸气压较高的毒物。