将已灭菌的
琼脂培养基加热到完全融化，倒在
培养皿内，每皿15ml（下层），待其凝固。此外，将融化的
PDA培养基冷却到50℃左右混入试验菌，将混有菌的培养基5 ml加到已凝固的培养基上待凝固（上层）。
以
无菌操作在培养基表面直接垂直放上牛津杯（内径6mm、外径8mm、高10 mm的圆形小管，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，在杯中加入待检样品（发酵液），牛津杯一般可以装240微升,在放置牛津杯、加注药品的时候要小心，以免药物渗漏，将试验平板移动至培养箱的过程中要避免牛津杯的打翻。加满后培养基正面向上置37℃培养16-18小时，观察结果，
抑菌圈用尺直接量就可以。在培养中,一方面试验菌开始生长，另一方面抗生素呈球面扩散，离杯越近，抗生素浓度越大，离杯越远抗生素浓度越小。随着抗生素浓度减小，有一条
最低抑菌浓度带，在带范围内，菌不能生长，而呈透明的圆圈，这就叫“抑菌圈”。抗生素浓度越高，抑菌圈越大。