磷酸化是将磷酸基团加在中间代谢产物上或加在蛋白质（protein）上的过程。

磷酸基团的添加或除去（去磷酸化）对许多反应起着生物“开/关”作用。磷酸基团的添加或除去能使酶（enzyme）活化或失活，控制诸如细胞分裂这样的过程。添加磷酸基团的酶称为激酶（kinases）；除去磷酸基团的酶称为磷酸酶。

磷酸化就是通过磷酸转移酶在底物上加上一个磷酸基团。

磷酸化（英语：Phosphorylation）或称磷酸化作用，是指在蛋白质或其他类型分子上，加入一个磷酸（PO4）基团，也可定义成“将一个磷酸基团导入一个有机分子”。此作用在生物化学中占有重要地位。 蛋白质磷酸化可发生在许多种类的氨基酸（蛋白质的主要单位）上，其中以丝氨酸为多，接着是苏氨酸。而酪氨酸则相对较少磷酸化的发生，不过由于经过磷酸化之后的酪氨酸较容易利用抗体来纯化，因此酪氨酸的磷酸化作用位置也较广为了解。

除了蛋白质以外，部分核苷酸，如三磷酸腺苷（ATP）或三磷酸鸟苷（GTP）的形成，也是经由二磷酸腺苷和二磷酸鸟苷的磷酸化而来，此过程称为氧化磷酸化。另外在许多糖类的生化反应中（如糖解作用），也有一些步骤存在氧化磷酸化作用。

信号传导中的作用：

（1）细胞内的信号蛋白主要分为两大类：一类在蛋白激酶的作用下磷酸化，共价结合ATP所提供的磷酸基团；另一类则在信号作用下结合GTP，通常以GTP取代GDP。

（2）这两种胞内信号蛋白的共同特征是，在信号达到时通过获得一个或几个磷酸基团而被激活，而在信号减弱时能去除这些基团，从而失去活性。在信号中继网中，某个信号蛋白磷酸化通常造成下游的蛋白依次发生磷酸化，形成磷酸化级联反应。

（3）蛋白质的磷酸化主要集中在肽链中的酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸残基上，这些残基上具有游离的羟基，且本身不带电荷，当磷酸化作用后，蛋白质便具有了电荷，从而使结构发生变化，进一步引起蛋白质活性的变化，这也是蛋白质磷酸化的意义所在。