膜片钳又称
单通道电流记录技术,用特制的玻璃微吸管吸附于
细胞表面,使之形成10~100的密封(giga-seal),又称巨阻封接,被孤立的小膜片面积为μm量级,内中仅有少数
离子通道。然后对该膜片实行电压钳位,可测量单个离子通道开放产生的pA(10的负12次方安培)量级的电流,这种通道开放是一种
随机过程。通过观测单个通道开放和关闭的电流变化,可直接得到各种
离子通道开放的电流幅值分布、开放几率、开放
寿命分布等功能参量,并分析它们与
膜电位、
离子浓度等之间的关系。还可把吸管吸附的膜片从
细胞膜上分离出来,以膜的外侧向外或膜的内侧向外等方式进行
实验研究。这种技术对小细胞的电压钳位、改变膜内外溶液成分以及施加药物都很方便。
1980年Sigworth等在
记录电极内施加5-50 cmH2O的负压吸引,得到10-100GΩ的高阻封接(Giga-seal),大大降低了记录时的噪声实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。
1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进,引进了膜片游离技术和
全细胞记录技术,从而使该技术更趋完善,具有1pA的电流灵敏度、1μm的
空间分辨率和10
μs的
时间分辨率。
1983年10月,《Single-Channel Recording》一书问世,奠定了
膜片钳技术的里程碑。Sakmann 和Neher也因其杰出的工作和突出贡献,荣获1991年诺贝尔医学和生理学奖。
应用膜片钳技术可以直接观察和分辨单
离子通道电流及其开闭时程、区分离子通道的离子选择性、同时可发现新的离子通道及亚型,并能在
记录单细胞电流和全细胞电流的基础上进一步计算出
细胞膜上的通道数和开放概率,还可以用以研究某些胞内或胞外物质对离子通道开闭及通道电流的影响等。同时用于研究
细胞信号的跨膜转导和
细胞分泌机制。结合
分子克隆和定点突变技术,膜片钳技术可用于离子通道
分子结构与生物学
功能关系的研究。
利用膜片钳技术还可以用于药物在其靶受体上作用位点的分析。如
神经元烟碱受体为配体门控性离子通道,膜片钳全细胞记录技术通过记录
烟碱诱发电流,可直观地反映出神经元烟碱受体活动的全过程,包括受体与其
激动剂和
拮抗剂的亲和力,
离子通道开放、关闭的动力学特征及受体的失敏等活动。使用膜片钳全细胞记录技术观察拮抗剂对烟碱受体激动剂量效曲线的影响,来确定其作用的动力学特征。然后根据分析拮抗剂对受体失敏的影响,拮抗剂的作用是否有电压
依赖性、使用依赖性等特点,可从功能上区分拮抗剂在
烟碱受体上的不同作用位点,即判断拮抗剂是作用在受体的激动剂识别位点,离子通道抑或是其它的变构位点上。
心肌细胞通过各种离子通道对
膜电位和
动作电位稳态的维持而保持正常的功能。国外学者在人类心肌细胞离子通道特性的研究中取得了许多进展,使得心肌药理学实验由
动物细胞模型向人心肌细胞成为可能。
通过对各种生理或病理情况下细胞膜某种离子通道特性的研究,了解该离子的生理意义及其在疾病过程中的作用机制。如对
钙离子在
脑缺血神经细胞损害中作用机制的研究表明,
缺血性脑损害过程中,Ca2+ 介导现象起非常重要的作用,缺血缺氧使Ca2+通道开放,过多的Ca2+进入细胞内就出现Ca2+超载,导致
神经元及细胞膜损害,
膜转运功能障碍,严重的可使神经元坏死
将
膜片钳技术与单细胞
逆转录多聚酶链是反应技术结合,在全
细胞膜片钳记录下,将单细胞
内容物或整个细胞(包括细胞膜)吸入电极中,将细胞内存在的各种
mRNA全部快速逆转录成
cDNA,再经常规
PCR扩增及待检的特异mRNA的检测,借此可对形态相似而电活动不同的结果做出分子水平的解释或为单细胞逆转录
多聚酶链式反应提供标本,为同一结构中形态非常相似但功能不同的事实提供分子水平的解释。国际上掌握此技术的实验室较少,我国
北京大学神经科学研究所于1994年在国内率先开展。
在通道电流记录中,可分别于不同时间、不同部位(膜内或膜外)施加各种浓度的药物,研究它们对通道功能的可能影响,了解那些选择性作用于通道的药物影响人和动物
生理功能的分子机理。这是膜片钳
技术应用最广泛的领域,既有对西药药物机制的探讨,也广泛用在重要药理的研究上。如
开丽等报道细胞贴附式膜片钳
单通道记录法观测到
人参二醇组
皂苷可抑制正常和“
缺血”诱导的
大鼠大脑皮层神经元L-型
钙通道的开放,从而减少钙
内流,对缺血细胞可能有保护作用。陈龙等报道采用细胞贴附式单通道记录法发现
乌头碱对培养的Wistar大鼠
心室肌细胞L-型钙通道有阻滞作用。
随着
膜片钳技术在心血管方面的广泛应用,对
血管疾病和
药物作用的认识不仅得到了不断更新,而且在其
病因学与
药理学方面还形成了许多新的观点。正如
诺贝尔基金会在颁奖时所说:“Neher和Sadmann的贡献有利于了解不同疾病机理,为研制新的更为特效的药物开辟了道路”。
在
离子通道高通量筛选中主要是进行
样品量大、筛选速度占优势、
信息量要求不太高的初级筛选。最近几年,分别形成了以膜片钳和
荧光探针为基础的两大主流
技术市场。将
电生理研究信息量大、灵敏度高等特点与自动化、微量化技术相结合,产生了自动化膜片钳等一些新技术。