酶分子中能够直接与底物分子结合，并催化底物化学反应的部位，这一部位就成为酶的活性中心。

活性中心必需的基团有：组氨酸的咪唑基、谷氨酸天冬氨酸的侧链羧基和丝氨酸的羟基。

观察酶分子被一定的化学试剂修饰前后酶活性的变化情况，结合其它方法，推断该基团是否为活性中心的功能基团。如胰凝蛋白酶与二异丙基氟磷酸（DIFP）作用即会失去活性。DIFP能与酶分子中的Ser残基共价结合，胰凝乳蛋白酶中有28个Ser 残基，而与DIFP作用的仅仅是其中的Ser195。这表明Ser 195是胰凝乳蛋白酶活性中心的组成部分。

是使用一个能与酶的活性中心特异结合的正常底物类似物作为活性部位基团的标记试剂。该类似物不能为酶所催化而发生化学反应，却能与酶的特定基团发生共价结合使酶失活。如N-对-甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲基酮（TPCK）是胰凝乳蛋白酶的亲和标记物，当用C14 标记的TPCK与胰凝乳蛋白酶一起保温时，酶即失活。结构分析证明TPCK 与酶分子中的His57发生作用。说明His57是活性中心的另一组成部分。

可直接观察酶与底物的结合情况。