酶细胞化学技术,化学反应技术。将细胞内的
酶与
底物相互作用, 再将酶反应的产物作为反应物质,在酶的作用部位进行捕捉,使其在显微镜下具有可见性。这种在酶作用下产生反应产物, 经捕捉反应来间接证明酶定位的反应称为酶的细胞
化学反应。
酶的细胞化学反应包括两个反应: 第一反应是酶作用于底物的反应, 称
酶反应,形成的产物称为初级反应产物;第二反应是捕捉剂与初级反应产物的作用,称捕捉反应,产生最终反应产物:
酶细胞化学的一个重要问题是既要保存好细胞内酶的活性,又要保存好细胞的结构,因此选择适当的固定剂种类、浓度、固定的方式和时间是细胞化学技术的一个关键问题。光镜样品固定多选用中性
福尔马林或
多聚甲醛,4℃、24小时,常规的石蜡包埋切片可以满足相当一部分酶的细胞化学要求;电镜样品固定通常用0.5~2%戊二醛或4%多聚甲醛,4℃、2小时,再切成5~100μm的厚片用于细胞化学反应,反应后经常规的锇酸后固定,脱水、包埋、超薄切片、至电镜下观察。冷冻切片能较大限度地保存酶的活性,因此是光、电镜酶细胞化学技术中常用的方法。
酶细胞化学反应实际上就是孵育反应的过程,孵育液的成分主要有酶的底物、捕捉剂,保证孵育液
pH的缓冲液以及有关的添加剂等。孵育的温度和时间可根据不同的酶和组织通过实验而确定。电镜酶细胞化学的样品在孵育反应后需经锇酸后固定、梯度乙醇脱水、环氧树脂包埋和超薄切片,至电镜下观察。