小干扰RNA（Small interfering RNA；siRNA）有时称为短干扰RNA（short interfering RNA）或沉默RNA（silencing RNA），是一个长20到25个核苷酸的双链RNA，在生物学上有许多不同的用途。已知siRNA主要参与RNA干扰（RNAi）现象，以带有专一性的方式调节基因的表达。此外，也参与一些与RNAi相关的反应途径，例如抗病毒机制或是染色质结构的改变。不过这些复杂机制的反应途径尚未明了。

小干扰RNA（siRNA），有时称为短干扰RNA或沉默RNA，是一类双链RNA分子，长度为20-25个碱基对，类似于miRNA，并且在RNA干扰（RNAi）途径内操作。它干扰了表达与互补的核苷酸序列的特定基因的转录后降解的mRNA，从而防止翻译。

siRNA由双链RNA (double strand RNA，dsRNA) 在细胞内被RNase III (如Dicer) 切割成21～25bp大小的双链RNA。dsRNA可以是外源的，如病毒RNA复制中间体或人工导入的dsRNA；也可以是内源的，如细胞中单链RNA在RNA依赖的RNA聚合酶的作用下形成的dsRNA 。

siRNA最早是由英国的大卫·包孔博（David Baulcombe）团队发现，是植物中的转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing；PTGS）现象的一部分，其研究结果发表于《科学》。2001年，汤玛士·涂许尔（Thomas Tuschl）团队发现合成的siRNA，可诱导哺乳动物体内的RNAi作用，结果发表于《自然》。这项发现引发了利用可控制的RNAi，来进行生物医学研究与药物开发的方法。

siRNA具有明确定义的结构：具有磷酸化5'末端的短（通常20至24bp）双链RNA（dsRNA）和具有两个突出核苷酸的羟基化3'末端。该切酶酶催化生产的siRNA由长的dsRNA和小发夹RNA。siRNA也可以通过转染引入细胞。由于原则上任何基因都可以被具有互补序列的合成siRNA敲低，因此siRNA是在后基因组时代验证基因功能和药物靶向的重要工具。

siRNA通常是一段长21个核苷酸的双链RNA（dsRNA），其两股分别在RNA的两端超出另一端2个核苷酸，图示如下：

每一股各有一个5'磷酸基末端与一个3'羟基末端。此结构是利用一种称为dicer的酶处理而得，这种酶可以将较长的双链RNA或小发夹RNA（small hairpin RNA）切成siRNA。此外，siRNA也可经由多种不同转染（transfection）技术导入细胞内，并对特定基因产生具专一性的敲弱（knockdown）效果。因此可利用经过适当剪裁的siRNA之互补性，来对已知序列的基因进行标定，这种现象使siRNA成为研究基因功能与药物目标的一项重要工具。

1.长dsRNA（可来自发夹，互补RNA和RNA依赖性RNA聚合酶）被称为Dicer的内切核糖核酸酶切割。Dicer切割长dsRNA以形成短干扰RNA或siRNA；这使得分子能够形成RNA诱导的沉默复合物（RISC）。

2.一旦siRNA进入细胞，它就会被整合到其他蛋白质中以形成RISC。

3.一旦siRNA是RISC复合物的一部分，siRNA就展开以形成单链siRNA。

4.由于其在5'末端的碱基配对而在热力学上较不稳定的链被选择作为RISC复合物的一部分。

5.作为RISC复合物一部分的单链siRNA现在可以扫描并找到互补的mRNA。

6.一旦单链siRNA（RISC复合物的一部分）与其靶mRNA结合，它就会诱导mRNA切割。

7.现在切割mRNA并被细胞识别为异常。这导致mRNA的降解，并且反过来不将mRNA翻译成氨基酸然后转化为蛋白质。从而沉默编码该mRNA的基因。

siRNA也类似于miRNA，然而，miRNA来自较短的茎环RNA产物，通常通过抑制翻译来沉默基因，并且具有更广泛的作用特异性，而siRNA通常通过在翻译前切割mRNA而起作用，并且具有100%的互补性，因此目标特异性非常严格。

通过转染外源siRNA进行的基因敲低通常是不令人满意的，因为该效应仅是短暂的，特别是在快速分裂的细胞中。这可以通过产生siRNA的表达载体来克服。修饰siRNA序列以在两条链之间引入短环。得到的转录物是短发夹RNA（shRNA），其可以通过Dicer以其通常的方式加工成功能性siRNA。典型的转录盒使用RNA聚合酶III启动子（例如，U6或H1）来指导小核RNA（snRNA）的转录（U6参与基因剪接；H1是RNase）人RNase P）的成分。理论上，所得的siRNA转录物然后由Dicer处理。

通过使用细胞挤压也可以提高基因敲低效率。

RNAi中siRNA的活性很大程度上取决于其与RNA诱导的沉默复合物（RISC）的结合能力。双链体siRNA与RISC的结合之后是用内切核酸酶解开和切割有义链。然后剩余的反义链-RISC复合物可以与靶mRNA结合以启动转录沉默。

已经发现dsRNA还可以激活基因表达，这种机制被称为“小RNA诱导的基因激活”或RNAa。已经显示靶向基因启动子的dsRNA诱导相关基因的有效转录激活。使用合成的dsRNA在人细胞中证明RNAa，称为“小活化RNA”（saRNA）。尚不清楚RNAa是否在其他生物体中是保守的。

siRNA诱导的转录后基因沉默始于RNA诱导的沉默复合物（RISC）的组装。该复合物通过切割编码靶基因的mRNA分子来沉默某些基因表达。为了开始该过程，两条siRNA链中的一条（引导链）将被装载到RISC中，而另一条链即过客链被降解。某些Dicer酶可能负责将引导链加载到RISC中。然后，siRNA扫描并指导RISC到mRNA分子上完全互补的序列。认为mRNA分子的切割由RISC的Argonaute蛋白的Piwi结构域催化。然后通过切割与siRNA残基10和11配对的靶核苷酸之间的磷酸二酯键精确切割mRNA分子，从5'端开始计数。这种切割导致mRNA片段被细胞核酸外切酶进一步降解。5'片段通过外来体从其3'末端降解，而3'片段从其5'末端通过5'-3'外切核糖核酸酶1（XRN1）降解。切割后靶mRNA链与RISC的解离允许更多的mRNA被沉默。这种解离过程很可能是由ATP水解驱动的外在因素促进的。

有时不会发生靶mRNA分子的切割。在一些情况下，磷酸二酯骨架的核酸内切裂解可以通过切割位点附近的siRNA和靶mRNA的错配来抑制。其他时候，即使靶mRNA和siRNA完全配对，RISC的Argonaute蛋白也缺乏内切核酸酶活性。在这种情况下，基因表达将被miRNA诱导机制沉默。

Ping-Pong方法的简化版本，涉及蛋白质Aubergine（Aub）和Argonaute-3（Ago3）切割piRNA的3'和5'末端。

Piwi相互作用的RNA负责转座子的沉默，而不是siRNAs。

最初，siRNA序列的选择是基于实验经验而获得的（Elbashir et al. 2001，2002）。最近，生物信息学工具被用来设计siRNA（表18-1），目前多个数据库收录了经过实验确证的siRNA和shRNA。值得推荐的是，在设计新的siRNA之前可以通过搜索已有的siRNA数据库和科研文献来寻找已确证的siRNA。如果不能获得已确证的siRNA，则应该为每个靶基因设计3~5条候选siRNA（Pei and Tuschl 2006）。以下将介绍如何挑选有效和特异性强的siRNA。有关siRNA设计的详细过程请参考Birmingham等（2007）的研究。

1、目标区域。siRNA通常以mRNA的CDS序列为靶点，因为一般认为，相对非编码序列而言，CDS序列容易成为RNA干扰的靶点且多态性更低。然而，当CDS不容易找到合适的siRNA结合位点，或者为了区分两个编码区相同但3'非翻译区（UTR）不同的基因时，3'端UTR也可以利用。5'端UTR和剪接点通常不被考虑，因为它们可能会被细胞内蛋白质复合体（如翻译起始机器或者外显子连接复合体）所包裹。

2、长度和非配对结构。尽管20~25个核苷酸长度、包含2个非配对碱基形成的3'端突出“尾巴”的双链siRNA显示出了与常规siRNA相当的效率，但常规的双链siRNA依然是长度为21个核苷酸、两端包含2个非配对碱基形成的3'端突出“尾巴”，模拟了Dicer酶体内切割的主要产物。长度超过30个碱基的双链RNA能够在哺乳动物体细胞中诱导干扰素反应。一些长度超过23个碱基的RNA双链体能够诱导细胞特异性的干扰素反应（Reynolds et al. 2006）。

3、热力学不对称性。进入RISC的siRNA链被称为“向导链”（图18-2）。这一siRNA链的5'端碱基配对较为松弛（动力学稳定性稍差），被RNA干扰机器识别为向导（Khvorova et al. 2003；Schwarz et al. 2003）。向导链进入RISC，两者之间的这种结合会通过5'端的G∶U错配得到加强。反之，也可以通过化学修饰减弱信使链（向导链的反义链，目标mRNA的同义链）与RISC的结合（Nykanen et al.2001；Chen et al. 2008）。

4、GC含量和核苷酸偏好。有关siRNA设计的大量分析显示：具有生物学功能的siRNA不能含有回文（palindromic）序列和内在重复序列，并且GC含量达到30%~52%。回文序列或者内在重复序列会形成二级结构，干扰与RISC以及目标mRNA的结合（Patzel et al. 2005）。GC含量过高或者过低会干扰两条siRNA链的分离，减慢与RISC的结合。此外，成熟RISC与目标mRNA的强烈结合会妨碍切割产物的释放，使酶的转换效率降低（Haley and Zamore2004；Tang and Zamore2004）。有关高效siRNA性质的多因素分析显示：向导链的第1~第7个碱基应该是U或者A，第10个碱基应为A或者U，第19个碱基应为G或者C（Pei and Tuschl 2006）。这些“规律”预示了向导链的结合喜好，使其与靶标保持适当的亲和力，促进对靶标的多轮切割。

5、RNA干扰介导的脱靶效应。RNA干扰介导的脱靶效应是指双链siRNA的向导链或信使链介导的对基因表达的非特异性抑制，具有浓度依赖性（图18-3）（Jackson et al. 2006a）。RNA干扰介导的脱靶效应通常会在siRNA发挥类似内源性miRNA的作用时发生，即通过小RNA向导链的“种子序列”（2~7位或2~8位核苷酸）与其目标mRNA结合（Lim et al. 2005；Lin et al. 2005；Birmingham et al. 2006）。目前已经有多种消除这种脱靶效应的方法。尽管通过同源性搜索（如BLASTn或者Smith-Waterman算法）来减少可能存在脱靶效应的siRNA的方法应用比较广泛，但这一方法仍不能消除大多数的脱靶效应，这是因为无法避免第6位和第7位核苷酸与细胞内mRNA匹配的偶然情况。通过将针对同一mRNA的多个无相关性siRNA混合使用以降低每一种siRNA浓度的方法可提高RNA干扰的特异性（Kittler et al. 2007），但是这种方法有着严格的适用要求。对siRNA向导链的第2位核苷酸进行不依赖于序列的化学修饰同样可以提高效率，这一方法减少了siRNA对既定靶标以及靶标之外mRNA的亲和力（Jackson et al. 2006b）。唯一被证实的可提高RNA干扰特异性的方法是设计siRNA分子，使其正确的RNA链进入有功能的RNAi酶复合体，或者可以对信使链进行化学修饰，以阻止其通过RNA干扰途径发挥作用（Elménet al. 2005）。

6、天然免疫反应和毒性。在哺乳动物中，如果siRNA包含富含G和U的序列基序，如GUCCUUCAA或者UGUGU，那么此siRNA有可能通过Toll样受体激活细胞内的天然免疫通路（Hornung et al. 2005；Judge et al. 2005；Marques and Williams 2005；Sioud 2005）。然而，其他的免疫刺激因素仍然有待鉴定，因为有一些siRNA虽富含G和U却不能激活免疫受体，而另一些缺少GUCCUUCAA或者UGUGU基序的siRNA反而具有免疫刺激活性。针对176个随机挑选的siRNA进行比较研究，鉴定出UGGC是一个毒性基序，能引发细胞死亡（Fedorov et al. 2006）。已知的免疫刺激活性和毒性基序可以通过计算预测而避免。另外，化学修饰，如锁状核酸（locked nucleic acid，LNA）（图18-4）和对免疫刺激活性和毒性基序进行2'-O-甲基化核酸修饰可以用于抑制其天然免疫刺激活性（Judge et al. 2006）。

化学合成siRNA

合成siRNA应用广泛，这种方法的得率和纯度都比较高。对合成siRNA还可以进行一系列化学修饰以提高siRNA的稳定性、降低脱靶效应，以及（或者）阻止激活天然免疫反应。多家公司，包括Ambion、Thermo Scientific Dharmacon、QIAGEN和Sigma-Aldrich Proligo等都能提供高质量的合成siRNA。在用于细胞之前，合成的正义和反义siRNA需在体外复性形成双链siRNA（方案1）。

利用酶学反应从长链dsRNA生成siRNA

利用重组Dicer酶或者细菌RNase Ⅲ对体外转录获得的长链dsRNA进行酶学消化也可以获得双链siRNA（Yang et al. 2002）。与合成siRNA相比，对长链dsRNA酶消化可以生成不同种类的siRNA，提高了生成功能性siRNA的可能性。然而，体外酶学反应生成siRNA的主要不足之处在于：这些siRNA在使用时不易选择对照。理论上，对照siRNA不应该与实验siRNA具备相同的种子序列。由于体外酶切生成的确切siRNA无从得知，那么也就无法选择精确的对照，因此，无法区分究竟是既定靶标mRNA还是脱靶基因的特定表型表达发生下调。

体外转录

利用合成的、含有噬菌体启动子的DNA寡核苷酸模板，经体外转录可以生成siRNA。通常，这一方法通过核酸酶或者核酶消化，确保产物拥有确定的末端以及（或者）5’端单磷酸或者羟基末端。这一方式能够以较低成本快速生成多个不同siRNA，但是风险主要存在于污染的三磷酸RNA会触发天然免疫反应（Kimet al. 2004）。

近年来，RNAi技术在病毒感染性疾病治疗方面的应用已受到极大关注，尤其在AIDS、乙型肝炎和丙型肝炎等治疗中的应用研究最为活跃。，在siRNA抗AIDS的研究中，针对HIV结构蛋白基因及长末端重复序列（longterminal repeat，LTR）的SiRNA可以控制病毒复制；针对宿主细胞HIV受体CD4基因的siRNA可有效控制病毒进入宿主细胞，抑制病毒的感染过程。但CD4是人体正常免疫功能不可缺少的分子，它的表达抑制势必影响正常的免疫功能，由此设想针对CCR5、CCR4等共同受体设计siRNA，并正在试验中。另外在抗病毒治疗中，分别以丙型肝炎病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、脊髓灰质炎病毒等基因组的编码区或非编码区为靶点设计的siRNA均取得了令人欣喜的体外抑制作用，但利用动物实验模型验证siRNA体内清除病毒的效果需进一步研究。

虽然RNAi有望成为抗病毒治疗的有效工具，但病毒株靶基因的高度突变或碱基丢失，如HIV和流感病毒，成为设计siRNA时必须考虑的问题。另外一种称为病毒抑制子蛋白的发现使研究人员对RNAi的抗病毒效应有了更深的认识，研究发现这种病毒抑制子由病毒基因组编码产生，最初在植物中发现，有报道别的真核生物中也存在，其与RNA干扰装置竞争性的结合，通过阻断siRNA的加工或干扰信号的传递等途径抑制RNA干扰，从而降低其抗病毒的效应。

针对上述影响因素，在RNAi抗病毒的治疗应用中，（1）靶序列的选择最好是针对病毒的保守序列，以减少病毒变异的影响。（2）设计针对不同靶序列的多种SiRNA并联合作用，以减少病毒逃逸的产生。（3）针对病毒进入细胞或病毒复制相关的宿主基因设计siRNA，如HIV受体CD4、CCR5等，这样即使病毒高度变异，其逃逸RNA干扰的几率也会大大降低。（4）针对病毒抑制子设计siRNA，可在一定程度上减少或避免病毒抑制子的产生，并且随着对RNA干扰的深入研究，将会有越来越多的相关报道。综上所述，RNAi在抗病毒治疗应用方面虽取得很大的突破，但其应用于临床还有待更深的研究。

2024年5月，蔡磊与中美瑞康合作开发的RAG-17正式在中国获批临床，成为临床渐冻症RNAi疗法。

2024年11月消息，中美瑞康自主研发的FUS基因靶向小干扰RNA(siRNA)疗法RAG-21，成功获得美国食品药品监督管理局(FDA)授予的孤儿药资格，用于治疗肌萎缩侧索硬化症(ALS)，俗称“渐冻症”。RAG-21是一种专门针对FUS基因突变的siRNA疗法，可有效降低FUS蛋白的水平，靶向运动神经元退化的根源。该药物通过RNA干扰(RNAi)机制发挥作用，通过降低FUS蛋白水平而减轻FUS蛋白的错误定位和异常聚集。临床前研究显示，RAG-21具有显著的敲低效果和良好的安全性。