基因枪法,又叫粒子轰击细胞法或
微弹技术。基因枪的作用是用
压缩气体(氦或氮等) 动力产生一种冷的气体
冲击波进入轰击室(因此可免遭由“热”气体冲击波引起的细胞损伤),把粘有
DNA 的细微金粉打向细胞,穿过
细胞壁、
细胞膜、
细胞质等层层构造到达
细胞核,完成
基因转移。只有很少部分的细胞符合这样的要求,大多数会因为力道不对而失败,但这少部分细胞已足够完成基因转移操作的需要。利用氦气、金粉的原因主要是: 密度大,穿孔容易; 口活性小,不易毒害细胞。
在1987年,Vlein首先报道了应用此技术将TMV(
烟草花叶病毒)RNA吸附到钨粒表面,轰击洋葱
表皮细胞,经检测发现
病毒RNA能进行复制,并以同样技术将CAT(Chloraphericol acetyltransferase氯霉素乙酰转移酶基因)
基因导入洋葱表皮细胞。该技术已在烟草、水稻、小麦、
黑麦草、甘蔗、棉花、大豆、
菜豆、洋葱、
番木瓜、
甜橙、
葡萄等多种作物上成功。
这一方法是依靠一种
基因枪来帮助导入
外源基因。基因枪根据
动力系统可分为火药引爆、
高压放电和压缩气体驱动三类。其基本原理是通过动力系统将带有基因的金属颗粒(金粒或
钨粒),将
DNA吸附在表面,以一定的速度射进
植物细胞,由于小颗粒
穿透力强,故不需除去
细胞壁和
细胞膜而进入
基因组,从而实现稳定转化的目的。它具有应用面广,方法简单,转化时间短,转化频率高,实验费用较低等优点。对于
农杆菌不能感染的植物,采用该方法可打破载体法的局限。基因枪的转化频率与受体种类、微弹大小、轰击压力、制止盘与金颗粒的距离、受体预处理、受体轰击后培养有直接关系。
基因枪法: 将直径4um的
钨粉或
金粉在供体DNA中浸泡,然后用基因枪将这些粒子打入细胞、组织或器官中,具有一次处理多个细胞的优点,但转化效率较低。另外这种方法也用于
基因治疗和抗体制备,并已取得初步成效。
基因枪法( Gene gun) 又称粒子轰击、高速粒子喷射技术或基因枪轰击技术, 是由美国Comel 大学生物化学系John. C. Santord 等于1983 年研究成功。首先在植物中获得成功应用。通过动力系统将带有基因的金属颗粒( 金粒或钨粒) ,将DNA 吸附在表面,以一定的速度射进
靶细胞,实现稳定转化的目的。小颗粒穿透力强,不需对靶细胞进行修饰。基因枪具有应用面广、方法简单、对治疗基因的大小要求不严格、转化时间短、
瞬时表达持续时间长、一次处理多个细胞、安全性高等优点。用比普通的
注射法低2 ~ 3 个
数量级的DNA 即可产生较高的保护作用,但
转化效率相对较低,是广泛应用且十分高效的免疫方法。
2003 年,有学者提出基因枪免疫无论是其介导产生的
抗体效价还是其所需的DNA 疫苗剂量,均优于肌注途径。Kim HJ 等人为了证明这一说法,将P.
vivax 的AMA - 1
基因克隆并在
质粒载体UBpcAMA - 1 中表达,可获得一个大约56. 8kDa 的蛋白。通过肌内免疫或者通过基因枪4 次免疫BALB/c 小鼠,在最后1 次注射的2 周后通过
流式细胞仪检测脾T 细胞亚型的比例。实验结果显示,
肌内注射的鼠
脾细胞在CD8 + T 细胞和
CD4 + T 细胞的比例中无意义; 然而,在运用基因枪免疫的鼠体内,观察到了显著增加( P <0. 05) 的CD8+ 细胞。结果表明,当其肌内注射编码P. vivax AMA - 1 的质粒DNA 疫苗时,产生的细胞
免疫原性很低; 然而,通过基因枪注射技术时可观察到明显效果。
通过基因枪转运金粒包裹的DNA 疫苗可抑制
肿瘤组织的生长。Abe A 等 通过皮内基因枪转运DNA ( pNGVL -hFLex) 包裹的金粒到靶肿瘤周围的鼠皮肤,检测通过基因枪介导的一种Flt3 配体FL ( 一种新发现的
细胞因子,可促进
树突状细胞的生长) 转移在鼠模型中对
肿瘤生长上的抑制效果。实验结果: 通过免疫组化学和荧光激活的细胞分类(
FACS)显示了基因枪介导的DNA ( pNGVL - hFLex) 的转移显著增加了CD11c ( + ) DCs 在肿瘤组织中的数量,抑制了MCA205 肿瘤的生长。从而得出,通过基因枪成功的进行了FL 治疗,在肿瘤组织中显著增加了DCs 细胞的数目并抑制了肿瘤的生长。
由于金粒成本过高,Chen Cad 等人比较了
裸DNA 疫苗和金粒包裹的DNA 疫苗分别通过低压基因枪和高压基因枪转运时在体内产生的
免疫效果。实验检测了低压的基因枪转运的非载体裸DNA 疫苗,同金珠包裹的DNA 疫苗相比能否产生相似的抗原特异的
免疫应答和抗肿瘤效果。结果显示: 在鼠体内,裸CRT/E7 DNA 疫苗导致更强烈的
免疫反应,大幅度的E7
特异性CD8 + T 细胞前体和E7 特异性抗体有所增加; 裸CRT/E7 DNA 疫苗产生强大的抗皮下的E7 表达肿瘤和抗E7 表达前的
转移性肺癌的抗肿瘤效果; 此外,裸CRT/E7 DNA
疫苗免疫的鼠
同用金珠包裹的CRT/E7 DNA 疫苗免疫的鼠相比在皮肤表面的
烧伤影响明显减少。实验最后得出: 裸CRT/E7DNA 疫苗通过低压基因枪转运,同传统的金珠包裹的DNA 疫苗相比,能产生相似强大的免疫应答和有效的抗肿瘤效果,且更方便,并具有更小的副作用。