基因靶向（英语：gene targeting，又称为基因打靶）是一种利用同源重组方法改变生物体某一内源基因的遗传学技术。这一技术可以用于删除某一基因、去除外显子或导入点突变，从而可以对此基因的功能进行研究。基因打靶的效果可以是持续的，也可以是条件化的。例如，条件可以是生物体发育或整个生命过程中的一个特定时刻，或将效应限制在某一特定组织中。基因打靶的优点在于可以应用于任何基因，无需考虑其大小和转录活性。

“基因靶向”技术，通常被称作基因敲除，是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其他相近基因取代，然后从整体上观察实验动物，推测相应基因的功能。

基因打靶技术是从20世纪80年代发展起来的，是建立在对同源重组不断了解的基础之上。首先是以酵母这种较为简单的真核模式生物为基础，来对相关技术进行研究。随着外源DNA导入酵母细胞方法的建立、标记基因有效选择的利用、同源重组转化子筛选系统的建立、载体同源序列DNA（靶标）双链断裂提高同源重组效率的利用，使得基因打靶技术逐渐成熟起来。而对于哺乳动物细胞，由于其基因组比酵母细胞要大且复杂，基因打靶的成功率很低。因此要将基因打靶技术应用于哺乳动物，还需要新的策略。1989年，利用胚胎干细胞，美国科学家马里奥·卡佩奇和奥利弗·史密斯与英国科学家马丁·埃文斯，将基因打靶技术成功地应用于小鼠；他们也因此获得了2007年诺贝尔生理学与医学奖。

2013年3月，云南中科灵长类生物医学重点实验室、中科院昆明动物研究所、南京医科大学、南京大学、同济大学等多家单位合作，利用目前世界最新的基因组编辑技术CRISPR/Cas9和TALENs实现猕猴和食蟹猴两个物种的靶向基因修饰，同年10月和11月分别获得世界首例经过CRISPR/Cas9基因靶向修饰及TALENs基因靶向修饰的两只小猴。

将外源DNA导入靶细胞后，利用基因重组，将外源DNA与靶细胞内染色体上同源DNA间进行重组，从而将外源DNA定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点。

对于不同的生物体，所使用的基因打靶的方法也不用。对于小鼠来说，大致的流程如下：

从小鼠胚胎上提取干细胞；

同时，构建靶载体，靶载体中含有与靶基因同源的DNA片段；

将靶载体转染到干细胞中；

将筛选后获得的含有靶载体的干细胞进行扩增；

将含有靶载体的干细胞注入小鼠胚胎；

胚胎发育为嵌合体小鼠（部分器官为该改造后的干细胞发育而成）后，通过选择性培育（将嵌合体小鼠与正常小鼠交配，在下一代中进行筛选），获得基因敲除小鼠（全部器官为该改造后的干细胞发育而成）。

修改后的方法还可用于其他哺乳动物，如牛、羊、猪等。

基因打靶技术还被用于一些植物，特别是小立碗藓的研究。

“基因靶向”技术利用胚胎干细胞改造老鼠体内的特定基因。在“基因靶向”技术的帮助下，科学家可以使实验鼠体内的一些“不活跃”基因失去作用，从而发现这些基因的实际功能。科学家希望借此发现人类一些疑难杂症在分子水平上的发病原因，并最终找到治疗途径。目前，“基因靶向”已被应用于对囊肿性纤维化、心脏病、糖尿病、阿尔茨海默症和癌症的研究。

在公报中，诺贝尔奖评审委员会指出，“基因靶向”的应用为人类的胚胎发育以及人类对抗衰老和疾病带来了希望。“在老鼠体内进行的‘基因靶向’已经渗透到生物医学的各个领域。在未来许多年内，它将继续帮助人类理解基因功能，继续造福人类。”公报中这样写道。 2007年度诺贝尔奖评选活动于8日在瑞典首都斯德哥尔摩拉开帷幕。瑞典卡罗林斯卡医学院当日宣布，将2007年度诺贝尔奖首个奖项——诺贝尔生理学/医学奖授予美国人马里奥·卡佩基、奥利弗·史密斯和英国人马丁·埃文斯 ，以表彰他们在干细胞研究方面尤其是“基因靶向”技术的发明方面所作的贡献。

“基因靶向”的技术也已经运用到医学以及化妆品领域中。

构建重组基因载体

绝大多数的基因敲除策略都是基于同源重组的机制，其基因载体包括载体骨架、靶基因同源序列和突变序列及选择性标记基因等非同源序列，其中同源序列是影响同源重组效率的关键因素。

用电穿孔显微注射方法

把重组DNA转入受体细胞（一般是胚胎干细胞）核内。

同源重组

基因重组时以载体的同源序列取代染色体靶位序列，实现载体DNA同源目的序列与染色体靶位点的同源重组。

筛选

用选择培养基筛选已击中的细胞。

表现型研究研究

将击中细胞转移入胚胎使其生长成为转基因动物，对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测。

RNAi引起的基因敲除：由于少量的双链RNA就能阻断基因的表达，并且这种效应可以传递到子代细胞中，所以RNAi的反应过程也可以用于基因敲除。