平板
菌落计数法,是种统计物品含菌数的有效方法。方法如下:将待测样品经适当稀释之后,其中的微生物充分分散成单个细胞,取一定量的稀释样液涂布到平板上,经过培养,由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落,即一个
单菌落应代表原样品中的一个单细胞;统计菌落数,根据其
稀释倍数和取样
接种量即可换算出样品中的含菌数。
方法简介
但是,由于待测样品往往不宜完全分散成单个细胞,所以,长成的一个
单菌落也可能来自样品中的2~3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果
准确度往往偏低。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果,已倾向使用
菌落形成单位(cfu :colony-forming units),而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。
菌落总数介绍
菌落是指细菌在
固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物,它是由数以万计相同的细菌集合而成。当样品被稀释到一定程度,与
培养基混合,在一定
培养条件下,每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。
菌落总数就是指在一定条件下(如需氧情况、
营养条件、pH、培养温度和时间等)每克(每毫升)检样所生长出来的
细菌菌落总数。按
国家标准方法规定,即在需氧情况下,37℃培养48h,能在普通
营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数,所以
厌氧或
微需氧菌、有
特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌,由于现有条件不能满足其
生理需求,故难以繁殖生长。因此
菌落总数并不表示实际中的所有
细菌总数,菌落总数并不能区分其中细菌的种类,所以有时被称为
杂菌数,
需氧菌数等。
菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及
卫生质量,它反映食品在
生产过程中是否符合卫生要求,以便对被检样品做出适当的
卫生学评价。菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。
检验方法
菌落总数的测定,一般将被检样品制成几个不同的10倍递增稀释液,然后从每个稀释液中分别取出1mL置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合,在一定温度下,培养一定时间后(一般为48小时),记录每个平皿中形成的菌落数量,依据稀释倍数,计算出每克(或每ml)原始样品中所含
细菌菌落总数。
基本操作一般包括:样品的稀释--倾注平皿--培养48小时--计数报告。
国内外
菌落总数测定方法基本一致,从检样处理、稀释、倾注平皿到计数报告无何明显不同,只是在某些具体要求方面稍有差别,如有的国家在样品稀释和
倾注培养进,对吸管内液体的流速,稀释液的振荡幅度、时间和次数以及放置时间等均作了比较具体的规定。
检验方法参见:
GB4789.2-94 《中华人民共和国国家标准 食品卫生微生物学检验 菌落总数测定》
SN0168-92 《中华人民共和国进出口商品检验行业标准 出口食品菌落计数》
说明
样品的处理和稀释
1.操作方法:以无菌操作取检样25g(或25ml),放于225mL
灭菌生理盐水或其他
稀释液的灭菌
玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的
玻璃珠)或
灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨制成1:10的均匀稀释液。
固体检样在加入稀释液后,最好置灭菌
均质器中以8000~10000r/min的速度处理1min,制成1:10的均匀稀释液。
用1ml灭菌吸管吸取1:10稀释液1ml,沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混合均匀,制成1:100的稀释液。
另取1ml灭菌吸管,按上项操作顺序,制10倍递增稀释液,如此每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管。
2.
无菌操作:操作中必须有“无菌操作”的概念,所用
玻璃器皿必须是完全灭菌的,不得残留有细菌或抑菌物质。所用剪刀、
镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装,应用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。
操作应当在
超净工作台或经过消毒处理的
无菌室进行。琼脂平板在工作台暴露15分钟,每个平板不得超过15个菌落。
3.采样的
代表性:如系固体样品,取样时不应集中一点,宜多采几个部位。固体样品必须经过均质或研磨,液体样品须经过振摇,以获得均匀
稀释液。
4.样品
稀释误差:为减少样品稀释误差,在连续递次稀释时,每一稀释液应充分振摇,使其均匀,同时每一
稀释度应更换一支吸管。
在进行连续稀释时,应将吸管内液体沿管壁流入,勿使吸管尖端伸入稀释液内,以免吸管外部粘附的检液溶于其内。
为减少稀释误差,SN标准采用取10mL稀释液,注入90mL
缓冲液中。
5.稀释液:样品稀释液主要是灭菌
生理盐水,有的采用
磷酸盐缓冲液(或0.1%
蛋白胨水),后者对食品中已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品(如酱油)进行稀释,可以采用灭菌
蒸馏水。
倾注培养
1.操作方法:根据标准要求或对污染情况的估计,选择2~3个适宜稀释度,分别在制10倍递增稀释的同时,以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中,每个稀释度做两个平皿。
将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿约15ml,并转动平皿,混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml
稀释液(不含样品)的灭菌平皿内作
空白对照。
待琼脂凝固后,翻转平板,置36±1℃温箱内培养48±2h,取出计算平板内菌落数目,乘以
稀释倍数,即得每克(每毫升)样品所含
菌落总数。
2.倾注用培养基应在46℃水浴
内保温,温度过高会影响细菌生长,过低琼脂易于凝因而不能与菌液充分
混匀。如无水浴,应以皮肤感受较热而不烫为宜。
倾注培养基的量规定不一,从12~20ml不等,一般以15ml较为适宜,平板过厚可影响观察,太薄又易于干裂。倾注时,培基底部如有
沉淀物,应将底部弃去,以免与菌落混淆而影响计数观察。
3.为使菌落能在平板上
均匀分布,检液加入平皿后,应尽快倾注培养基并旋转混匀,可正反两个方向旋转,检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min,以防止细菌有所死亡或繁殖。。
4.培养温度一般为37℃(水产品的培养温度,由于其
生活环境水温较低,故多采用30℃)。培养时间一般为48h,有些方法只要求24h的培养即可计数。
培养箱应保持一定的湿度,琼脂
平板培养48h后,培养基失重不应超过15%。
5.为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与
细菌菌落发生混淆,不易分辨,可同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板,不经培养,而于4℃环境中放置,以便计数时作对照观察。
在某些场合,为了防止食品颗粒与菌落混淆不清,可在
营养琼脂中加入
氯化三苯四氮唑(TTC),培养后菌落呈红色,易于分别。
计数和报告
1.操作方法:培养到时间后,计数每个平板上的菌落数。可用肉眼观察,必要时用
放大镜检查,以防遗漏。在记下各平板的
菌落总数后,求出同
稀释度的各平板平均菌落数,计算处原始样品中每克(或每ml)中的菌落数,进行报告。
2.到达规定培养时间,应立即计数。如果不能立即计数,应将平板放置于0-4℃,但不得超过24h。
3.计数时应选取菌落数在30~300之间的平板(SN标准要求为25~250个菌落),若有二个稀释度均在30~300之间时,按国家标准方法要求应以二者比值决定,比值小于或等于2取
平均数,比值大于2则其较小数字(有的规定不考虑其比值大小,均以平均数报告)。
4.若所有稀释度均不在计数区间。如均大于300,则取最高
稀释度的平均菌落数乘以
稀释倍数报告之。如均小于30,则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。如菌落数有的大于300,有的又小于30,但均不在30~300之间,则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如所有稀释度均无菌落生长,则应按小于1乘以最低稀释倍数报告之。有的规定对上述几种情况计算出的菌落数按估算值报告。
5.不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比(同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近),即稀释倍数愈高菌落数愈少,稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象,则应视为检验中的差错(有的食品有时可能出现逆反现象,如酸性饮料等),不应作为检样计数报告的依据。
6.当平板上有链状菌落生长时,如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限,则应作为一个菌落计,如存在有几条不同来源的链,则每条链
均应按一个菌落计算,不要把链上生长的每一个菌落分开计数。如有片状菌落生长,该平板一般不宜采用,如片状菌落不到平板一半,而另一半又分布均匀,则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。
7.当计数平板内的菌落数过多(即所有稀释度均大于300时),但分布很均匀,可取平板的一半或1/4计数。再乘以相应
稀释倍数作为该平板的菌落数。
8.菌落数的报告,按国家标准方法规定菌落数在1~100时,按实有数字报告,如大于100时,则报告前面两位
有效数字,第三位数按四舍五入计算。固体检样以克(g)为单位报告,液体检样以毫升(ml)为单位报告,表面涂擦则以
平方厘米(cm)报告。