酶抑制法是利用酶的功能基团受到某种
物质的影响，而导致酶活力降低或丧失作用的现象进行检测的方法。该物质即称为酶抑制剂。酶抑制剂对酶有选择性，是研究酶作用机理的重要工具。很多药物，毒物和用于化学战争的毒剂都是酶抑制剂。此外，还有一些具有一定功能的存在于动植物体内的生物大分子也是酶抑制剂。 酶受抑制时其蛋白部分并未变性。由于酶蛋白变性造成的酶失活作用，以及除去活化剂（如酶活力所必需的金属离子）而造成酶活力的降低或丧失，不属于
酶抑制作用的范畴。主要用于农药残留检测。
抑制剂（I）和底物（S）对游离酶（E）的结合有竞争作用，互相排斥。这种抑制剂称为
竞争性抑制剂。已结合S的ES复合体不能再结合I；已结合I的EI复合体也不能再综合S，即不存在IES三联复合体。可用下式表示（其中P代表产物）：
竞争性抑制剂与底物在结构上常有类似之处，可与底物竞争酶的结合位点。例如
琥珀酸脱氢酶的底物琥珀酸是丁二酸，而它的竞争性抑制剂是丙二酸，二者在结构上是同系物。
抑制剂不与游离酶结合，而与酶底物复合体结合而成三联复合体，三联复合体不能再分解生成产物。E和s的结合反而促进E和I的结合。可用下式表示： 从上式可知，当反应体系中加入抑制剂I时，可使E+S和ES的平衡倾向ES的形成。因此I的存在反而增加E和S的亲和力。此情况正和竞争性抑制作用相反，故称为
反竞争性抑制作用。
L-苯丙氨酸等一些氨基酸对
碱性磷酸酶的作用是
反竞争性抑制。在多底物反应中，反竞争性抑制作用比较常见。
底物和抑制剂与游离酶的结合完全互不相关，既不排斥也不促进，底物与游离酶结合后，不影响抑制剂同游离酶的结合；同样，抑制剂与游离酶结合后，也不影响底物与酶的结合。但三联复合体也不再分解生成产物。可用下式表示：
当反应体系中加入抑制剂时，既可使游离酶和复合体IE的平衡倾向IE，又可使ES与IES的平衡倾向IES。例如乌本苷是细胞膜上钠-钾腺苷三磷酸（Na+—K+ATP）酶的
非竞争性抑制剂。严格的
非竞争性抑制作用（即表现为Ki=K′i者）比较少见，一些介于竞争性和非竞争之间的抑制作用通常称为混合性抑制作用。
利用有机磷和
氨基甲酸酯类农药对动物体内
乙酰胆碱酶（AChE）具有抑制作用的原理，在乙酰胆碱酯酶及其底物（乙酰胆碱）的共存体系中加入农产品样品提取液（样品中含有水），如果样品中不含有有机磷或氨基甲酸酯类农药，酶的活性就不被抑制，乙酰胆碱就会被酶水解，水解产物与加入的显色剂反应就会产生颜色；反之，如果试样提取液中含有一定量的有机磷或氨基甲酸酯类农药，酶的活性就被抑制，试样中加入的底物就不能被酶水解，从而不显色。用目测颜色的变化或
分光光度计测定吸光度值，计算出抑制率，就可以判断出样品中农药残留的情况。AChE属于丝氨酸为中心的酶类，羧酸酯酶与AChE类似，同样以丝氨酸残基作为活动中心。
酶抑制法只能检测对AChE具有抑制作用的有机磷和氨基甲酸酯类农药，对其他类型农药造成的污染无法检出，而且方法的灵敏度比较低，如对伏杀磷、
水胺硫磷、涕灭威有时还有假阳性。
速测卡以滤纸作为载体，白纸片上载有乙酰胆碱酶和基质，红纸片载有显色剂。当空白样品加于白纸片上，在酶作用下，乙酰胆碱与水发生水解，水解产物与显色剂反应产生颜色。当含有有机磷和氨基甲酸酯类农药样品加于白纸片上时，抑制了乙酰胆碱酶的活性，使这种酶不能被水解，从而无显色反应。