简单重复序列标记(Simple Sequence Repeats标记,简称SSR标记)是一种以特异引物PCR为基础的
分子标记技术,也称为
微卫星DNA(MicrosatelliteDNA),是一类由几个核苷酸(一般为1~6个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的
串联重复序列。每个SSR两侧的序列一般是相对
保守的
单拷贝序列。
另一类是由无功能的序列组成的。根据
重复序列的重复单位的长度,可将串联重复序列分为
卫星DNA、
微卫星DNA、
小卫星DNA等〔3〕。微卫星DNA又叫
简单重复序列,指的是
基因组中由1~6个
核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA,广泛分布于基因组的不同位置,长度一般在200bp以下。研究表明,
微卫星在
真核生物的基因组中的含量非常丰富,而且常常是
随机分布于核DNA中〔15,38〕。在植物中通过对
拟南芥〔7〕、玉米〔35〕、水稻〔11〕、小麦〔28,32,33〕等的研究表明微卫星在植物中也很丰富,
均匀分布于整个植物基因组中,但不同植物中微卫星出现的频率变化是非常大的,如在主要的农作物中两种最普遍的二核苷酸重复单位(AC)n和(GA)n在水稻、小麦、玉米、烟草中的数量分布频率是不同的。在小麦中估计有3000个(AC)n序列重复和约6000个(GA)n序列重复,两个重复之间的距离平均分别为704kb、440kb〔32,33〕,而在水稻中,(AC)n序列重复约有1000个左右,(GA)n重复约有2000个,重复之间的平均距离分别为450kb、225kb〔41〕。另外在植物中也发现一些三核苷酸和四核苷酸的重复,其中最常见的是(AAG)n、(AAT)n〔15〕。在单子叶和
双子叶植物中SSR数量和分布也有差异,平均分别为64.6kb和21.2kb中有一个SSR。研究还发现,
单核苷酸及二核苷酸重复类型的SSR主要位于
非编码区,而有部分三核苷酸类型位于
编码区。另外在
叶绿体基因组中,也报道了一些
微卫星,以A/T序列重复为主〔3〕。
研究发现,
微卫星中重复单位的数目存在高度变异,这些变异表现为微卫星数目的整倍性变
异或重复
单位序列中的序列有可能不完全相同,因而造成多个位点的
多态性。如果能够将这些变异揭示出来,就能发现不同的SSR在不同的种甚至不同个体间的多态性,基于这一想法,人们发展起了SSR标记。SSR标记又称为sequence tagged microsatellite site,简写为
STMS,是最常用的
微卫星标记之一。由于
基因组中某一特定的微卫星的侧翼序列通常都是
保守性较强的
单一序列,因而可以将微卫星侧翼的DNA片段克隆、测序,然后根据微卫星的侧翼序列就可以人工合成
引物进行
PCR扩增,从而将单个
微卫星位点扩增出来。由于单个微卫星位点
重复单元在数量上的变异,个体的扩增产物在长度上的变化就产生长度的
多态性,这一多态性称为简单序列重复长度多态性(
SSLP),每一扩增位点就代表了这一位点的一对
等位基因。由于SSR重复数目变化很大,所以SSR标记能揭示比
RFLP高得多的多态性,这就是SSR标记的原理。
与其它
分子标记相比,SSR标记具有以下优点:(1)数量丰富,覆盖整个
基因组,揭示的
多态性高;(2)具有多
等位基因的特性,提供的
信息量高;(3)以
孟德尔方式遗传,呈
共显性;(4)每个位点由设计的
引物顺序决定,便于不同的实验室相互交流合作开发引物。
因而该技术已广泛用于
遗传图谱的构建、目标基因的标定、
指纹图的绘制等研究中。但应看到,SSR标记的建立首先要对
微卫星侧翼序列进行克隆、
测序、人工设计合成
引物以及标记的定位、作图等基础性研究,因而其开发费用相当高,各个实验室必须进行合作才能开发更多的标记。由于SSR标记具有较大的应用价值,且
种属特异性较强,在一些主要的农作物中SSR标记研究都进行了合作,共同进行
STMS引物的开发。