卫星DNA(satelliteDNA)是一类
高度重复序列DNA。在介质
氯化铯中作
密度梯度离心(
离心速度可以高达每分钟几万转)时,
DNA分子将按其大小分布在
离心管内不同密度的氯化铯介质中,小的分子处于上层,大的分子处于下层。从离心管外看,不同层面的DNA形成了不同的条带。根据
荧光强度的分析,可以看到在一条
主带以外还有一个或多个小的卫星带。这些在卫星带中的DNA即被称为卫星DNA,这种DNA的片段含有异常高或低的G+C含量,常会在主要DNA带附近相伴一个次带,其
浮力密度曲线出现在主带的前面或后面。
分类
卫星DNA按其
浮力密度的大小可以分成I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四类,其浮力密度分别是1.687,1.693,1.697和1.700g/cm3。各类卫星DNA都是由各种不同的
重复序列家族所组成。卫星DNA通常是
串联重复序列。卫星DNA按其
重复单元的
核苷酸的多少,可以分为两类。一类是
小卫星DNA(minisatelliteDNA),由几百个
核苷酸对的单元重复组成。另一类是
微卫星DNA(microsatelliteDNA),由2个到20个左右的核苷酸对的单元重复成百上千次所组成。卫星DNAI家族由42bp的单元组成,其中17bp(ACATAAAATATAAAGT)为
可变区,25bp(ACCCAAAAAGTTATTATATACTGT)为
重复单元。卫星DNAⅡ家族是
保守性差的ATTCC重复。卫星DNAⅢ是较保守的ATTCC重复,且与10bp的序列(ATCGGGTTG)相间分布。卫星DNA还有另一些分类的名称,如
α卫星DNA是
灵长类特有的单元为171bp的
高度重复序列,最初是在
非洲青猴
基因组中发现,已经确定分布在人染色体的
着丝粒区。β卫星DNA家族是单元为68bp的
串联重复序列,富含
GC。γ卫星DNA是220bp的
串联重复。第Ⅳ类卫星DNA称为隐藏的卫星DNA(cryptilsatellite)。这是包含了多种串联重复序列的
DNA分子,离心时并不像卫星DNA那样也分开,但它的属性却类似卫星DNA。卫星DNA位于有重要功能的
真核染色体的着丝粒和
端粒上。
基本信息
卫星
DNA标记(microsatelliteDNA)是近十多年发展起来的一种新型的
分子遗传标记。它具有数量大、分布广且均匀、
多态信息含量高、检测快速方便等特点,已经被广泛应用于动、植物
基因定位、
连锁分析、
血缘关系鉴定、
遗传多样性评估、
系统发生树构建、
标记辅助选择等方面。
微卫星DNA又称短串联重复序列(shorttandemrepeat,STR)或
简单重复序列(simplesequencerepeats,
SSR),广泛随机地分布于
真核生物基因组中,在
DNA序列中平均每6kb就可能出现一个,约占人基因组的10%,其基本构成单位(
核心序列)为1-6bp,呈串联
重复排列而成。按核心序列
碱基数不同可分别称为单二、三、四、五或六核苷酸,
碱基组成分别有2(A/T,C/G),4(AC/TG,AG/TC,AT/TA,CG/GC)10,102和350种。人类
基因组中以(
CA/GT)n,简称(CA)n
重复序列最多,总共约有5×104-105个,即平均每6-60kbDNA就存在一个(CA)n,重复次数约15~16次;相应地,
大鼠平均为18kb,
小鼠平均为16kb,绵羊平均65kb(Crawford等,1995)。与其它DNA多态标记一样,
微卫星DNA呈孟德尔
共显性方式遗传(Winter,1992)。
Weber(1990)按照重复结构的不同,把
微卫星标记分为完全重复型(perfect)、不完全重复型(imperfect)和复合型(
compound)三种。完全重复型指由不中断的重复单位构成的
微卫星;不完全重复型指重复单位中间有3个以下的非重复
碱基,且其两端不中断的部分重复数大于3;复合型指微卫星两端或两类以上的串联重复单位由不多于3个连续的非重复碱基分隔开,但各不中断的重复单位的重复数大于或等于5。
关于卫星的产生机理,多数学者认为是
DNA复制和
修复过程中的滑动
错配或染色体
减数分裂时
姊妹染色单体不均等交换的结果(Tachida等,1992;Tautz等,1984),微卫星在
基因组中的功能尚不清楚,已发现微卫星能参与遗传物质的结构改变,
基因调控及
细胞分化等过程,有自身特异
结合蛋白,尚能
直接编码蛋白质,是一种非常活跃的
碱基序列,
微卫星核心序列是高度保守的,它与希氏
大肠杆菌的
Chi序列相似,揭示微卫星核心序列可能是与重组有关的蛋白质连接位点。微卫星可直接编码蛋白质,如
脆性X综合症基因内(CGG)n串联重复,编码30个
精氨酸;(CAG)n是人类
基因库DNA序列外显子中发现最多的一种。另外,微卫星在促进染色体凝集,维持染色体结构等方面也有作用,可参与染色体折叠、
染色体端粒形成等。(CA/GT)n、(GATA)n可能与致育性、
性别分化、
X染色体失活有关。
系统特点
卫星DNA具有多态性和保守性,卫星位点由
微卫星的
核心序列与其两侧的
侧翼序列构成,侧翼序列使某一卫星特异地定位于染色体的某一部位,而卫星本身的重复单位变异则是形成
微卫星多态性的基础。在某一个体
基因组中两条
同源染色体的相对(侧翼序列相同)位置上如两侧翼序列间所包含的卫星重复单位数相同与不同,则分别表现为
纯合基因型和杂合基因型。卫星DNA的保守性表现在
哺乳动物之间,特别是一些紧密相关的物种如牛与羊、
马属动物之间以及鸡与
火鸡之间具有一定程度的保守性。Moore等(1995)用牛的卫星引物分别在羊、马及人的基因组中进行扩增发现,在羊中56%的引物可扩增出特异产物,其中42%的扩增产物表现出
多态性;而在马及人中未扩增出多态产物。Levin等(1995)用48个鸡
微卫星位点的引物,以火鸡的
基因组DNA进行扩增发现:92%的引物可扩增出产物,33%的扩增产物经鉴定是与鸡同样的微卫星,其中28%的产物表现出多态性。由于卫星DNA引物在物种间的通用性,使得物种如牛、
绵羊、
山羊之间引物的互用成为可能。Gortari等(1997)研究表明;58%的牛引物可以在绵羊中扩增出特异产物且40%的扩增产物表现出多态性。Vaiman等(1996)的研究同样表明34%的牛引物以及绵羊引物在山羊中呈多态且其发表的第一个公山羊
遗传图谱中的219卫星标记中,有45个来自绵羊卫星,164个来自牛卫星。Schibler等(1998)在人的遗传图谱中寻找到了43个牛和绵羊的卫星及34个山羊卫星。许多研究结果表明
反刍动物中的牛、绵羊和山羊3个物种在染色体水平上具有高度的
相关性,因此,可用牛的卫星标记引物来构建绵羊或山羊的遗传
基因图谱。
卫星DNA
PCR扩增的高度灵敏性、高度特异性使得微卫星的检测十分方便而且准确。传统的方法是将PCR产物在非变性或
变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳进行
基因分型。对于
荧光素、
同位素或
生物标记的引物,可以采用其相应的
显示方法,而对不带标记的引物可以
银染后观察结果。
荧光标记自动
测序技术的发展使得
微卫星DNA的基因分型变得快速、准确,从而大大地提高了
微卫星标记分型效率和
准确率,同时节约了实验成本和时间,使得应用
微卫星进行了大规模
基因组扫描成为可能。
优点
卫星DNA具有很多优点,然而如何获得所需要的卫星位点,一般有以下两种方法:一种是利用卫星位点的保守性,从卫星数据库中搜索出某物种已知卫星引物,然后以相近物种的
基因组总DNA为模板,用已知引物进行扩增并进行
多态性分析,再对特异扩增产物进行测序,从而获得适合另一物种的高度多态的
微卫星位点。另一种方法则是直接从
基因组文库中筛选卫星位点。随着科技的发展,“随机扩增卫星
DNA多态性”法和借助染色体
显微切割等手段使得新卫星位点的发现效率更高,更为简单。
标记应用
卫星标记应用
遗传多样性的分析与评估,生物个体表现出的各种
遗传变异,在本质上就是DNA的差异,因此通过研究DNA的变异来分析群体的
遗传结构及遗传多样性则更为直接,Arranz等(1996)对牛的卫星DNA和
蛋白质标记的
比较研究发现卫星标记比蛋白质标记具有更加丰富的
多态性,且其两者所得到的
系统发生树基本上是一致的。这些都说明,卫星在研究
亲缘关系较近的
群体遗传关系时是较优越的标记之一。van-zeveren等(1995)利用7个卫星标记对4个
比利时猪种进行了研究,通过
等位基因频率、
多态信息含量(PIC)、遗传
杂合度、
有效等位基因数及品种内个体相似概率等5个指标的比较,得出了品种内的
遗传差异和遗传关系。Li等(2000)用卫星方法对中国七个地方猪种
遗传多样性的研究表明,
中国地方猪种的遗传多样性高于外来品种,七个品种的聚类与它们的地理分化时间大致吻合。MacHugh等(1996,1997,1998)借助20个卫星标记对7个欧洲牛品种,6个非洲牛品种和4个
亚洲牛品种的遗传结构进行检测,分析了各个牛品种内的
遗传变异及品种间的遗传关系,并对来自三大洲的普通牛和
瘤牛起源,驯化和
系统发生关系做好了深入探讨。Zhou等(1999)对23个高度
近交系鸡的42个卫星位点进行了分析,绘制了
系统发生树,结果表明卫星在遗传多样性的研究上是准确可靠的。Morin等(1994)用人源卫星位点来检查自由生活状态下的
黑猩猩种群的亲缘关系、社会结构和子关系,使其得以验证种群内关于亲缘关系的假说。
用途
可以把某一个体的
遗传物质完整地传递下去,因而它对于保存并传播优良个体和珍稀
濒危动物的
基因组具有重大意义。确定异种
重构胚的核是否来自于供体的核就显得异常关键。
中国科学院昆明动物研究所丁波、张亚平等人建立了一种从早期
囊胚中提取
DNA以进行核内和核外DNA分析的方法。用这种方法从异种克隆
大熊猫重构胚中提取总DNA,以大熊猫特异的卫星DNA
引物成功地扩增出了卫星座位g010。
PCR产物双向测序表明,2个重构胚与大熊猫供体对照序列完全一致。结果证明该异种大熊猫重构胚的核的确来自大熊猫供体
细胞核。
Ingram认为无毛鼹鼠是一个任意交配的群体,造成一个个体的DNA标记microsatellites来源广泛,而不是像人类那样,只能从父亲和母亲那儿获得两套系统。通过寻找在这个传代的过程中无毛鼹鼠
社会结构与模式的变化,Ingram发现经过一代又一代的繁衍,无毛鼹鼠越来越多的“
兄弟姐妹”,以至于它们之间的相似度比它们与父母之间的相似度更大,因此也就越趋向于
社会生活,并且秉承由上代传下来的习俗共同生活。而且Ingram得出结论认为某种动物种类越少,其基因池(genepool)也越小。通过这一研究,不仅了解了无毛鼹鼠的生活习惯与规律,而且为人类控制有害物种十分有利。
卫星DNA
卫星DNA它是由2-6
bp重复单位构成的
DNA序列,通常
多态性片段长度在100-300bp。以人类
基因组为例,平均每15-20kb就存在1个STR座位,据此估计整个
人类基因组中大约有50,000-100,000个STR位点。由于
微卫星DNA具有高度的多态性和遗传稳定性,所以非常适合作为遗传学DNA分子标记,STR分析已广泛应用于遗传制图、连锁性分析、
亲子鉴定、疾病
基因定位和物种
多态性研究等诸多领域。
当肯定子代某个
标记基因来自生父,而假设父亲也带有这个基因的情况下,则不能排除它是该子代的生父,这一结论主要是根据实验结果来进行分析。当得到父代和子代的
微卫星位点扩增
电泳图后,可以根据各个个体间实验结果的相似程度来确定它们之间的关系。更方便的方法是用
扫描仪对电泳图扫描,获得各位点的检测峰值图,峰值曲线一样的个体可以判定存在父子关系,并可估计出它是该子代生父的可能性大小。
亲子鉴定2-亲子关系的排除
利用微卫星位点的
多态性,以
微卫星位点在一定群体中各
等位基因频率为基础,用排除
亲子关系概率来表示对假设父亲的排除可能性大小,同时也表示了该标记在
亲子鉴定中的能力,这个概率取决于群体中该标记
基因型及其频率的大小。