噬菌体展示技术(phage display technology)是将
外源蛋白或多肽的
DNA序列插入到
噬菌体外壳蛋白
结构基因的适当位置,使
外源基因随外壳蛋白的表达而表达,同时,外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。
定义
到2017年为止,人们已开发出了单链丝状
噬菌体展示系统、
λ噬菌体展示系统、
T4噬菌体展示系统等数种噬菌体展示系统。
原理
噬菌体展示技术是将
多肽或蛋白质的编码基因或
目的基因片段克隆入
噬菌体外壳蛋白
结构基因的适当位置,在
阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下,使外源多肽或蛋白与外壳蛋白
融合表达,
融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和
生物活性,以利于靶分子的识别和结合。肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后,洗去未结合的游离噬菌体,然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体,洗脱的噬菌体感染
宿主细胞后经繁殖扩增,进行下一轮洗脱,经过3轮~5轮的“吸附-洗脱-扩增”后,与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集[2]。所得的噬菌体制剂可用来做进一步富集有期望结合特性的目标
噬菌体。
系统
(1)PⅢ展示系统。丝状
噬菌体是单链DNA
病毒,PⅢ是病毒的次要外壳蛋白,位于病毒颗粒的尾端,是噬菌体感染
大肠埃希菌所必须的。每个病毒颗粒都有3个~5个拷贝PⅢ蛋白[3],其在结构上可分为N1、N2和CT 3个功能区域[4-5],这3个功能区域由两段富含
甘氨酸的连接肽G1和G2连接。其中,N1和N2与噬菌体吸附大肠埃希菌
菌毛及穿透
细胞膜有关[6],而CT构成噬菌体外壳蛋白结构的一部分,并将整个PⅢ蛋白的
C端结构域锚定于噬菌体的一端[7]。PⅢ有2个位点可供外源序列插入,当外源的多肽或蛋白质融合于PⅢ蛋白的
信号肽(SgⅢ)和N1之间时,该系统保留了完整的PⅢ蛋白,
噬菌体仍有
感染性;但若外源多肽或蛋白直接与PⅢ蛋白的CT结构域相连,则噬菌体丧失感染性,这时重组噬菌体的感染性由
辅助噬菌体表达的完整PⅢ蛋白来提供。PⅢ蛋白很容易被
蛋白水解酶水解,所以有辅助噬菌体
超感染时,可以使每个噬菌体平均展示不到一个
融合蛋白,即所谓“单价”噬菌体。
(2)PⅧ及其他展示系统。PⅧ是丝状噬菌体的主要外壳蛋白,位于噬菌体外侧,C端与
DNA结合,
N端伸出噬菌体外,每个病毒颗粒有2 700个左右PⅧ拷贝[8-9]。PⅧ的N端附近可融合五肽,但不能融合更长的
肽链,因为较大的多肽或蛋白会造成空间障碍,影响噬菌体装配[2,10-11],使其失去感染力。但有
辅助噬菌体参与时,可提供
野生型PⅧ蛋白,降低价数,此时可融合多肽甚至抗体片段。 此外,尚有丝状
噬菌体PⅥ展示系统的研究报道[12]。PⅥ蛋白的C端暴露于噬菌体表面,可以作为外源蛋白的融合位点,可以用于研究外源蛋白C端结构区域功能。从所掌握的文献来看,该系统主要用于
cDNA表面展示文库的构建,并取得了不错的筛选效果。
(1)PV展示系统。λ噬菌体的PV蛋白构成了它的尾部管状部分,该
管状结构由32个
盘状结构组成,每个盘又由6个PV亚基组成。PV有两个折叠区域,C端的折叠结构域(非功能区)可供外源序列插入或替换。用PV系统已成功展示了有活性的
大分子蛋白
β-半乳糖苷酶(5 ku)和植物外源
凝血素BPA(120 ku)等[13]。λ噬菌体的装配在细胞内进行,故可以展示难以分泌的肽或蛋白质。该系统展示的外源蛋白质的
拷贝数为平均1个分子/
噬菌体,这表明外源蛋白质或多肽可能干扰了λ噬菌体的尾部装配。
(2)D蛋白展示系统。D蛋白的
分子质量为11 ku,参与
野生型λ噬菌体头部的装配。低温电镜分析表明,D蛋白以
三聚体的形式突出在
壳粒表面[13]。当突变型噬菌体
基因组小于野生型基因组的82%时,可以在缺少D蛋白的情况下完成组装,故D蛋白可作为外源序列融合的载体,而且展示的外源多肽在空间上是可以接近的。病毒颗粒的组装可以在体内也可以在体外,体外组装即是将D
融合蛋白结合到λD-
噬菌体表面,而体内组装是将含D
融合基因的
质粒转化入λD-溶源的大肠埃希菌菌种中,从而补偿
溶源菌所缺的D蛋白,通过热诱导而组装。该系统有一个很好的特点,噬菌体上融合蛋白和D蛋白的比例可以由宿主的抑制tRNA活性加以控制,这对于展示那些可以对噬菌体装配造成损害的蛋白质时特别有用。
T4噬菌体展示系统是20世纪90年代中期建立起来的一种新的展示系统。它的显著特点是能够将两种性质完全不同的外源
多肽或蛋白质,分别与T4
衣壳表面上的外壳蛋白SOC(9 ku)和HOC(40 ku)融合而直接展示于T4噬菌体的表面,因此它表达的蛋白不需要复杂的蛋白纯化,避免了因纯化而引起的
蛋白质变性和丢失。T4噬菌体是在
宿主细胞内装配,不需通过
分泌途径,因而可展示各种大小的多肽或蛋白质,很少受到限制。吴健敏等成功地将大小约215 aa SOC/m E2
融合蛋白展示于T4噬菌体衣壳表面[14]。令人值得关注的是,SOC与HOC蛋白的存在与否,并不影响T4的生存和繁殖。SOC和HOC在
噬菌体组装时可优于DNA的包装而装配于
衣壳的表面,事实上,在
DNA包装被抑制时,T4是双股
DNA噬菌体中能够在体内产生空衣壳的噬菌体(SOC和HOC也同时组装)。因此,在用重组T4做疫苗时,它能在空衣壳表面展示目的抗原,这种缺乏DNA的空衣壳苗,在
生物安全性方面具有十分光明的前景[14]。
缺点分析
(1)在
噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、
噬菌体包装,有的展示系统还要经过跨膜
分泌过程,这就大大限制了所建库的容量和分子多样性。常用的
噬菌体展示文库中含有不同序列分子的数量一般限制在109。
(2)不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达,因为有些蛋白质功能的实现需要折叠、转运、膜插入和络合,导致在体内筛选时需外加
选择压力。例如,在噬菌体展示文库试验中,由于部分未折叠的蛋白在细菌中很容易被降解,因此,必须小心
控制条件,以
保证在噬菌体表面展示的文库没有降解。另外,鼠源抗体在噬菌体中表达差,也是体内选择压力的一个例子。
真核细胞蛋白在细菌中表达差是因为它们的
蛋白质合成与折叠机制不同的缘故[15]。
(3)噬菌体展示文库一旦建成,很难再进行有效的体外突变和重组,进而限制了文库中分子遗传的多样性。
(4)由于
噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达,所以,一些对细胞有毒性的分子如
生物毒素分子,很难得到有效表达和展示。
噬菌体展示技术
确定抗原
表位,包括表位的序列和构象,是免疫学家感兴趣的一个问题。表位的确定不仅可以了解有关
免疫反应的众多信息,为进一步
人工控制免疫反应奠定基础,而且对药物合成、疫苗设计等也具有指导意义。确定表位常用的方法有:还原法、
蛋白印迹法、肽扫描、突变分析等,后两种方法还同时解决了蛋白分子一级序列问题。但这些方法大多困难而繁琐。
00年以后,噬菌体展示技术成为探测蛋白
空间结构、探索受体与
配体之间相互作用
结合位点、寻找高亲和力和
生物活性的配体分子的有利工具,在蛋白分子相互识别的研究、
新型疫苗的研制以及
肿瘤治疗等研究领域产生了深远的影响。肽库(peptide library)的应用为确定
表位序列以至其构象提供了另一有力工具。
噬菌体展示肽库是以
噬菌体外壳蛋白PⅢ或PⅧ基因为载体,插入一段编码
外源短肽的
基因片段,噬菌体的浸染能力不受到影响,而外源短肽亦可在噬菌体表面PⅢ或PⅧ蛋白N末端形成一定的空间构象。1990年Scott将随机短肽与丝状噬菌体的表面蛋白PⅢ融合,并展示在噬菌体表面,首次建立了噬菌体
随机肽库。
从噬菌体展示随机肽库中筛选
抗原表位的基本原理是生物淘选(biopanning)。以
单克隆抗体筛选蛋白质抗原表位为例,其
基本技术流程如下:将
单抗包被聚乙烯平皿后,再加入
噬菌体展示肽库,使其充分与单抗反应后,洗去未结合的游离
噬菌体,再用
洗脱液将结合状态的噬菌体洗脱下来。将其浸染宿主
大肠杆菌扩增后回收,再进行下一轮筛选。通常经过3、4轮的筛选,并且每次增加筛选强度,这样就可获得与单抗结合较紧密的噬菌体克隆。通过
序列测定和分析,就能推知该噬菌体克隆所携带的外源短肽序列,从而确定该单抗所针对的
抗原表位。
借助于噬菌体展示肽库技术,已经成功分析了多种蛋白质
抗原的
表位,如
HIV(Keller et al., 1993; 杜勇等,2000)、HBV、
HCV(杜勇等,1999;Francesca et al., 2001;
潘卫等,2001)、
日本血吸虫(欧阳理等,2002)等,说明完全可以利用随机肽库鉴定抗原的线性和构象表位,大大简化了重组
免疫原的克隆、鉴定和表达等过程,为
表位鉴定研究增添了新的手段。
丝状
噬菌体具有
免疫原性,无须
佐剂即可产生抗体,这意味着
噬菌体展示系统可以作为候选疫苗抗原表位的递呈工具。利用展示
肉毒梭菌中和
表位的噬菌体不加佐剂直接免疫
小鼠,血清
ELISA检测显示,免疫小鼠是对照小鼠的
OD值的2~10倍。表明噬菌体展示的表位具有明显的
抗原性。
噬菌体展示技术的优点 噬菌体展示技术作为一种新兴的
研究方法和工具,在研究
蛋白质结构上已被广泛应用。它具有很多显著的优点,如:
A.高通量的淘选 将靶标分子(抗体)固定在固相载体上,加入
噬菌体展示肽库(
噬菌体的数量可达1011 PFU),利用抗原-抗体的特异性亲和力将与抗体结合的噬菌体吸附在固相载体上,不能结合的噬菌体仍在溶液中,可以通过洗涤去除,再将特异结合的噬菌体洗脱下来,如此反复数轮扩增、淘选,即可将有用的基因从多达百万以上的噬菌体克隆中分离出来。
B.可用于模拟
表位的筛选利用噬菌体展示技术得到模拟表位的报道较多(Giuseppe, 2001;Seshi et al., 2002;Ouyang et al., 2003)。李全喜等(1997)利用单抗9E10筛选
噬菌体随机肽库,结果获得了两个
阳性克隆,其中一个与抗原天然序列同源,而另一个则完全不同(即为模拟表位)。模拟表位同样可诱发与天然表位相似的
特异性免疫反应,例如利用乙肝病毒的模拟表位免疫小鼠可诱导产生高
滴度的乙肝病毒抗体。
C.易于纯化重组噬菌体的纯化步骤简单、不要求昂贵的试剂与设备,在一般的实验室条件下就可以完成。用于鉴定表位和受体所用的
噬菌体载体为13
单链噬菌体。由于
M13噬菌体是
温和型噬菌体,不裂解宿主菌,成熟的噬菌体可分泌到
培养基中,通过离心收集培养上清,再向其中加入
沉淀剂即可将上清中大量噬菌体粒子沉淀下来,从而富集得到含外源
基因产物的重组噬菌体。
尽管如此,在噬菌体展示技术中仍然存在一些不足。首先,所建的肽
库容量只能达到109,要想构建大片段的肽库很困难。其次,需要解决肽库的多样性问题。第三,少数多肽由于
疏水性过强,或由于影响外膜蛋白的折叠而不能展示在
噬菌体表面。作为一种新技术,类似的具体问题还很多。但这些暂时的缺点并不能掩盖其巨大应用潜力。
发展概况
发展历史
1985年,Smith G P[1]第一次将外源基因插入丝状噬菌体f1的基因Ⅲ,使
目的基因编码的多肽以
融合蛋白的形式展示在
噬菌体表面,从而创建了噬菌体展示技术。该技术的主要特点是将特定分子的
基因型和表型统一在同一病毒颗粒内,即在噬菌体表面展示特定
蛋白质,而在噬菌体
核心DNA中则含有该蛋白的
结构基因。另外,这项技术把
基因表达产物与亲和筛选结合起来,可以利用适当的靶蛋白将目的蛋白或多肽挑选出来。
发展前景
随着噬菌体展示技术的日益完善,该技术在众多基础和应用研究领域产生的影响已日渐明显。