高通量筛选(High throughput screening,HTS)技术是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础,以微板形式作为实验工具载体,以自动化操作系统执行试验过程,以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据,以计算机分析处理
实验数据,在同
一时间检测数以千万的样品,并以得到的相应
数据库支持运转的
技术体系,它具有微量、快速、灵敏和准确等特点。简言之就是可以通过一次实验获得大量的信息,并从中找到有价值的信息。
性能特点
高通量筛选时每天要对数以千万的样品进行检测,工作枯燥,步骤单一,操作人员容易疲劳、出错。自动化操作系统由计算机及其操作软件、自动化加样设备、温孵离心设备和
堆栈4个部分组成。自动化操作系统代替
人工操作显然有诸多优势,它利用
计算机通过操作软件控制整个实验过程,编程过程简洁明了。
应用
充分利用药用资源
由于高通量筛选依赖数量庞大的样品库,实现了药物筛选的规模化,较大限度地利用了药用
物质资源,提高了药物发现的几率,同时提高了发现新药的质量。
微量筛选系统
由于高通量筛选采用的是细胞、分子水平的筛选模型. 样品用量一般在
微克级(μg),节省了样品资源,奠定了“一药多筛”的物质基础,同时节省了
实验材料,降低了单药筛选成本。
高度自动化操作
随着对
高通量药物筛选的重视程度不断提高,用于高通量药物筛选操作设备和检测仪器都有了长足发展,实现了计算机控制的自动化,减少了
操作误差的发生,提高了
筛选效率和结果的
准确性。
多学科理论和技术的结合
在高通量筛选过程中,不仅应用了普通的
药理学技术和理论,而且与
药物化学、分子生物学、
细胞生物学、数学、
微生物学、
计算机科学等多学科紧密结合。这种多学科的有机结合,在药物筛选领域产生大量新的课题和发展机会,促进了药物
筛选理论和技术的发展。
筛选技术
实验方法
高通量筛选的实验方法分子水平和细胞水平的实验方法(或称
筛选模型)是实现药物高通量筛选的技术基础。由于药物高通量筛选要求同时处理大量样品,实验体系必须微量化,而这些微量化的实验方法应根据新的科研成果来建立。
第四军医大学周四元研究认为,药物高通量筛选模型的实验方法,根据其生物学特点,可分为以下几类:受体结合
分析法;
酶活性测定法;细胞分子测定法;细胞活性测定法;代谢物质测定法;
基因产物测定法。这些实验方法,
均已广泛用于药物高通量筛选中。
特色效用
高通量筛选的特色效用高通量筛选技术是将多种
技术方法有机结合而形成的一种新技术体系,它以微板形式作为实验工具载体,以自动化操作系统执行实验过程,以灵敏快速的检测仪器采集
实验数据,以计算机对数以千计的样品数据进行分析处理,从而得出科学准确的实验结果和特色效用。英国学者AlanD研究提示,一个实验室采用传统的方法,借助20余种
药物作用靶位,1年内仅能筛选75000个样品;1997年高通量筛选
技术发展初期,采用100余种靶位,每年可筛选100万个样品;1999年高通量筛选技术进一步完善后,每天的筛选量就高达10万种化合物。
FLIPR荧光检测法
近年来,
光学测定技术在美、英两国研究人员在高通量筛选检测中,努力进行了光学测定方法的研究,建立了大量的非同位素标记测定法,如用
分光光度检测法筛选
蛋白酪氨酸激酶抑制剂、组织纤溶酶原激活剂等,均获得成功。
放射性检测技术美国学者GanieSM在
高通量药物筛选研究中,应用放射性测定法,特别是亲和闪烁(SPA)检测方法,使在
96孔板上进行的
样本量实验得到发展。该方法灵敏度高,
特异性强,促进了高通量药物筛选的实现,但存在环境污染问题。
荧光检测技术美国学者Giulianok A研究认为,采用FLIPR(fluorometric imaging reader)荧光检测法,可在短时间内同时测定荧光的强度和变化,对测定细胞内
钙离子流及测定细胞内pH和细胞内
钠离子流等,是非常理想的一种高效检测方法。同时采用FDSS(Functional Drug Screening System)进行实时
多通道荧光检测,96
微孔板、384微孔板、1536微孔板一次性加样,实现实时
荧光强度信号检测,可以进行如下应用:
·GPCR calcium influx assays
–All calcium wash or non-washing kits (Fluo-4 or Fura-2
based), Premo™ Cameleon, Aequorin
·Ion Channel assays
–FMP, VSP,
potassium channel (FluxOR™),
sodium channel (SBFI and ANG-2), chloride channel (YFP)
·Enzymatic assays
–Prolyl isomerase, GTPase, Kvb
·Transporter assays
·CytoStar-T
·Circadian clock
·Mosquito Odorant Receptors
·Light activated receptor or channel assays
多功能微板
检测系统由
西安交通大学药学院研制的1536
孔板高通量多功能微板检测系统,是国际上先进的高通量检测系统,它可使筛选量进一步提高,现已在该院投入使用。
AlphaScreen检测法
AlphaScreen assay应用广泛且拥有众多优点,更优化药物
筛检试验的效果。其操作
硬体之限制,导致这实验方法虽然已研发数年,大多数研究人员并未知晓或广泛应用它。
化学生物学研究项目的研究重点是在我们的平台上执行的筛选与
蛋白质相互作用的高通量检测。为了这个目的,我们采用AlphaScreen assay(Amplified Luminescence Proximity Homogeneous Assay),正如它的名字所暗示的,ALPHA屏是基于发光接近检测。
AlphaScreen技术主要优势在于待测物质的范围宽泛,从小分子到大型复合物;
均相体系、快速、稳定,灵敏度更高;AlphaScreen检测也不需要
荧光标签的引入,避免了空间位阻影响
生物分子的相互结合;可用于检测生物学
粗提物例如细胞裂解物、血清、血浆、体液等,而不会影响
测读效果。
AlphaScreen技术主要的限制在于反应体系对于强光或是长时间的室内
光敏感;其次,某些化合物对于单体
氧分子的捕获会降低光信号;供体珠光漂白效应使得信号检测以单次为佳。与
ECL、FMAT技术相似,AlphaScreen也需要
高能激光器;同其他技术相比,AlphaScreen对于检测仪器平台有要求。
技术进展
我国进行药物高通量筛选的优势首先是化合物来源广泛,且多为天然;其次是对化合物
生物活性的筛选目的较明确,无目的合成的化合物较少;第三,我国传统药物为筛选研究提供了一个巨大的
资源库,可从中药中提取分离筛选新的化合物。这些优势为药物的高通量筛选打下了坚实基础。
我国药物高通量筛选初现规模:药物高通量筛选工作在我国起步较晚,且不规范。这几年,我国进行了
外引内联的整体化、规模化
基础建设,已初见成效。1996年
中国医学科学院引进国内第一台Biomek2000型实验
自动化工作站;1998年又引进全国第一台Topcount微量
闪烁计数器,使放射
配基实验、
放射免疫实验等技术微量化、自动化。
上海药物研究所、
北京军事医学科学院分别成立了
药物筛选专门机构,开始从事大规模筛选工作。西安交通大学药学院
贺浪冲教授首创的
细胞膜色谱(CMC)为化合物的体外高通量筛选提供了高选择性、高特异性、高效率的筛选手段。CMC已成功用于
钙离子拮抗剂受体
配体结合反应的研究,正在进行心血管化学合成药物的高通量筛选和中药
有效部位及
有效成分的寻找。将利用
分子生物学方法建立CMC自动化筛选体系,促进我国药物高通量筛选技术的
全面发展。
高通量筛选技术,是药物筛选领域研究的重要课题,近年来,对它的研究应用虽然已取得了长足的发展,但仍然存在许多难题,如体外模型的筛选结果与整体
药理作用的关系;对高通量筛选模型的
评价标准以及新的药物作用靶点的研究和发现等。随着
医药学的进步,高通量筛选技术在
创新药物的研发中,一定会开拓出更广阔的空间。