能够将聚核苷酸链的磷酸二酯键切断的酶，称为核酸酶。核酸酶属于水解酶，作用于磷酸二酯键的P-O位置。

有些核酸酶能从DNA或RNA链的一端逐个水解下单核苷酸，所以称为核酸外切酶。只作用于DNA的核酸外切酶称为脱氧核糖核酸外切酶，只作用于RNA的核酸外切酶称为核糖核酸外切酶；也有一些核酸外切酶可以作用于DNA或RNA。核酸外切酶从3′端开始逐个水解核苷酸，称为3′→5′外切酶，例如，蛇毒磷酸二酯酶即是一种3′→5′外切酶，水解产物为5′核苷酸；核酸外切酶从5′端开始逐个水解核苷酸，称为5′→3′外切酶，例如：牛脾磷酸二酯酶即是一种5′→3′外切酶，水解产物为3′核苷酸。

核酸内切酶催化水解多核苷酸内部的磷酸二酯键。有些核酸内切酶仅水解5′磷酸二酯键，把磷酸基团留在3′位置上，称为5′-内切酶；而有些仅水解3′-磷酸二酯键，把磷酸基团留在5′位置上，称为3′-内切酶。还有一些核酸内切酶对磷酸酯键一侧的碱基有专一要求，例如胰脏核糖核酸酶（RNaseA）即是一种高度专一性核酸内切酶，它作用于由嘧啶核苷酸C‘3处的羟基与下一个核苷酸C5’处的磷酸形成的3‘，5’-磷酸二脂键，产物为以3′嘧啶核苷酸结尾的低聚核苷酸和以5’核苷酸开头的低聚核苷酸。

20世纪70年代，在细菌中陆续发现了一类核酸内切酶，能专一性地识别并水解双链DNA上的特异核苷酸顺序，称为限制性核酸内切酶（restriction endonuclease，简称限制酶）。当外源DNA侵入细菌后，限制性内切酶可将其水解切成片段，从而限制了外源DNA在细菌细胞内的表达，而细菌本身的DNA由于在该特异核苷酸顺序处被甲基化酶修饰，不被水解，从而得到保护。

限制性核酸内切酶的研究和应用发展很快，已提纯的限制性核酸内切酶有100多种，许多已成为基因工程研究中必不可少的工具酶。

限制性核酸内切酶可被分成三种类型。Ⅰ型和Ⅲ型限制酶水解DNA需要消耗ATP，全酶中的部分亚基有通过在特殊碱基上补加甲基基团对DNA进行化学修饰的活性。

Ⅰ型和Ⅲ型酶具有限制和修饰两种作用，而特异性弱，切割位点的序列不固定，不已知，不宜用于基因克隆中。

Ⅱ型限制酶水解DNA不需要ATP也不以甲基化或其它方式修饰DNA，能在所识别的特殊核苷酸顺序内或附近切割DNA。因此，被广泛用于DNA分子克隆和序列测定。

关于网上描述核酸酶的本质是RNA，有一定误区。

首先，核酸酶的本质是蛋白质。

1，如图1是核酸酶的三级结构。可以看出核酸酶是由氨基酸合成的。

2，从发展历史上看：

RNA的催化作用是在1985年Cech等人对四膜虫rRNA自我剪接机制地深入研究时发现的。而基因工程在1980年就成功做成世界上第一只转基因动物（小鼠）。也就说1980年就已经用核酸酶来切割DNA获取目的基因了，而RNA类酶（核酶）的催化作用是在1985年才发现并提出来的。

请注意区分核酶（Ribozyme，有生物催化功能的RNA）和核酸酶（RNAse/DNAse，水解核酸的酶）