杜正伦在隋朝仁寿年间与兄长
杜正玄、
杜正藏一同考中秀才。他善写文章，精通佛典，后被授为羽骑尉。隋代仅有秀才十余人，而杜家却一门三秀才，因此受到时人称道。唐朝武德年间，杜正伦担任齐州总管府录事参军，后被秦王
李世民（即后来的
唐太宗）招纳，进入秦王府
文学馆。
贞观元年（627年），尚书右丞
魏徵上表举荐杜正伦，称其才能古今无比。唐太宗遂擢升杜正伦为兵部
员外郎，并对他道：“我让大臣推荐
行能出众之人，并不是我偏爱这种人，而是因为他们对百姓有益处。而对于宗室
勋臣中品行才干不佳的人，我绝对不会任用他们。我现在任用你，是因你忠诚正直，希望你能称职。”
贞观二年（628年），杜正伦又改任给事中，负责记载《
起居注》。唐太宗曾道：“我坐朝理政，每讲一句话，都要先思考这句话是否有益于百姓，所以我不敢多说话。”杜正伦答道：“君主言行都要记录在史书中，我的职责便是撰写起居注，所以不敢不尽忠职守。陛下如有片言只语违背道理，不仅会对当今百姓造成损害，即使千年之后都会有损
圣德。希望陛下慎重。”太宗大悦，赐其绢帛二百段。
贞观四年（630年），杜正伦进拜中书侍郎。贞观六年（632年），杜正伦与御史大夫
韦挺、秘书少监
虞世南、著作郎
姚思廉一同上疏奏事。唐太宗设宴款待，并道：“我发现历代
人臣如遇开明之主，就能竭尽忠诚规劝谏诤，至于像
龙逢、
比干这样的忠贞之臣，竟然免不了被加刑杀戮。为君不易，为臣更难。龙有逆鳞，君主也有逆鳞，你们却敢于去碰触。如果能经常这样，我哪还有什么危亡的忧虑！”又对他们大加赏赐。
不久，杜正伦改任太子左庶子，兼崇贤馆学士，并加
散骑常侍。唐太宗嘱咐道：“太子自古便是国家根本，一定要选有道德的人来辅佐。现在太子年纪幼小，志向思想还没确定，我如能早晚都见到他，还能随时随事对他告诫约束。我如今让他
监国，又不能把他留在身边。你志向远大，胸怀宽广，能坚持正道，所以我只能让你离开我去辅助太子，你应该知道这个委任的分量。”
贞观十年（636年），杜正伦再次出任中书侍郎，仍兼太子左庶子，并赐爵南阳
县侯。唐太宗曾嘱咐杜正伦：“我儿患有足疾，只是小事，但却好狎昵小人，以致没有好的名声，你要时时规劝。如果他不听教导，你就来告诉我。”后来，杜正伦数次劝谏太子李承乾，都未被接受，便将太宗的话告知于他。李承乾上表抗辩。唐太宗质问道：“你为何把我的话告诉太子？”杜正伦答道：“我劝导他，他不接受，所以就用陛下的话来吓唬他，希望他有所畏惧，或许可以改恶从善。”唐太宗大怒，将杜正伦外放为谷州刺史，又贬
交州都督。
贞观十七年（643年），李承乾意图谋反，被废为
庶人。经查证，李承乾曾命
侯君集赠送
金带给杜正伦。唐太宗于是将杜正伦流放驩州（在今越南境内）。后来，杜正伦又历任
郢州刺史、石州刺史。
显庆元年（656年），杜正伦被授为黄门侍郎，兼崇贤馆学士，后升任
同中书门下三品，成为宰相。
显庆二年（657年），杜正伦兼任
度支尚书，又升任中书令，兼
太子宾客、
弘文馆学士，进封襄阳
县公。他与
刘祥道曾上疏
唐高宗，认为
入流品官过多，乃是为政弊端。高宗便让杜正伦与刘祥道一同负责精简
品官，但因阻力过大，最终无果而终。
显庆三年（658年），中书令
李义府因与杜正伦不睦，诬告杜正伦与中书侍郎李友益结党营私。唐高宗遂将杜正伦贬为横州刺史，并削去他的
封邑。不久，杜正伦病死于
贬所。
贞观年间，杜正伦被唐太宗选为
东宫辅臣，教导太子李承乾。他出入于皇帝所在的
太极宫与太子所在的东宫，参与机密，以干练著称。担任宰相后，杜正伦又上疏高宗，建议精简入流品官。
杜正伦出身洹水杜氏，与
京兆杜氏同出一祖，但支系较远。他曾请求与京兆杜氏同谱，却被拒绝，便怀恨在心。京兆杜氏聚居处名为杜固，相传有旺盛发达的地气，因此世代高门。杜正伦拜相后，以疏通
水道为名建议朝廷开凿杜固，想借此破坏杜固的风水。杜固被凿后，川流如血，十日方止，从此南杜（北杜居于
杜曲）一蹶不振。
曾巩：当
房杜之时，所与共事则
长孙无忌、岑文本，主谏诤则魏郑公、王珪，振纲维则
戴胄、刘洎，持宪法则张元素、
孙伏伽，用兵征伐则
李勣、
李靖，长民守土则李大亮。其余为卿大夫，各任其事，则马周、
温彦博、杜正伦、
张行成、
李纲、虞世南、褚遂良之徒，不可胜数。
王夫之：长孙无忌、褚遂良、
于志宁、高季辅、张行成，太宗所任以辅己者也，贬死黜废，不能以一日安矣，保禄位以
令终，唯怀奸之李勣耳。自是而外，若
韩瑗、
来济、杜正伦、
刘仁轨、
上官仪、刘祥道，较无覆之伤，而斥罪旋加，幸免者亦托于守边以免祸。
《
全唐文》收录有其表疏三篇：《弹将军张瑾等文》《弹将军李子和文》《请慎言疏》。《
唐文拾遗》则补录铭文一篇：《
释法护葬铭》。