植物体的细胞中,含有该植物所有的
遗传信息。 在合适的条件下,一个细胞可以独立发育成完整的植物体。 利用细胞的这种
全能性,生物学家通过组培来繁殖名贵花卉、消灭果树上的病毒,以及通过对
细胞核物质的重新组合,进行植物遗传改造等。这就是人们常说的植物细胞工程。
基本概念
所谓
细胞工程,是指以细胞为
基本单位进行培养、增殖或按照人们的意愿改造细胞的某些生物学特性,从而创造新的生物和物种,以获得具有
经济价值的生物产品。
细胞工程根据研究材料的不同,可分为植物细胞工程和
动物细胞工程,均主要由两部分构成。
其一是上游工程,包含
细胞培养、
细胞遗传操作和细胞保藏三个步骤。
第二则是
下游工程,是将已转化的细胞应用到生产实践中去,以生产生物产品的过程。
顾名思义,
植物细胞工程,是在细胞水平上针对植物细胞的细胞工程,它是细胞工程的一个重要组成部分。
历程
自1904年Hanning成功培养离体胚以来,伴随着相关理论与技术的飞速发展,植物细胞工程也取得了巨大的成就。我们已经可以利用
细胞融合及
DNA重组等
现代生物技术从细胞和分子水平改良现有品种甚至于组建新品种。
1983年
转基因植物问世,并于1986年起被批准进入田间试验,
美国APHIS到97年1月31日已批准多达两千五百八十四例田间试验。不仅如此,一些
转基因植物已经开始进行商业化生产。
从1994年Calgene公司的延熟番茄FLAVRSAVRTM成为首例被批准进行商业化生产的
转基因作物开始,其后截止至1997年1月,美国已批准十七例,
加拿大十八例,
澳大利亚四例,日本七例。
我国
农业部也已于97年上半年批准了
转基因延熟番茄的商业化。由此可见,植物细胞工程将对我们的生活产生越来越大的影响,我们应对此加以重视,了解一些新的研究成果及新技术,以求在
生物工程这个二十一世纪的龙头产业中占有一席之地。
操作与技术
技术原理
植物细胞具有
全能性,即具有某种生物全部
遗传信息的任何一个细胞,都具有发育成完整生物体的潜能。而让细胞发挥出全能性的方法,就是细胞脱分化。
细胞脱分化,就是让已经分化的细胞,经过诱导后,失去其特有的结构和功能而转变成为
未分化细胞,进而形成
愈伤组织。愈伤组织在一定的
培养条件下,分化出
幼根和芽,进而形成完整小
植株,这就是愈伤组织再分化。
培养技术
植物细胞工程涉及诸多理论原理及实际操作技术,最重要的自然是培养技术,也就是将植物的器官、组织、细胞甚至
细胞器进行离体地、
无菌的培养。它是对细胞进行
遗传操作及细胞保藏的基础。此类
技术发展起步较早,相对而言已比较成熟,各种
培养基制备及很多操作方法已经基本规范化。针对植物的培养主要有
植物组织培养、
植物细胞培养、
花药及
花粉培养、离体
胚培养以及原生质体培养这几个大类,每一种都还可可以继续细分为更具体的小类。
组织培养首先将
外植体分离出来,然后在无菌及适当条件下培养以诱导出
愈伤组织,另外在愈伤组织随外植体生长一段时间后还需要进行继代培养,以避免
代谢产物积累及水分散失等因素的影响。
细胞培养可分为悬浮细胞培养、
平板培养、
饲养层培养和双层滤纸植板几类,它们都是将选定的植物细胞于适当的条件下进行培养,以得到大量基本同步化的细胞,为
遗传操作提供材料。
花粉及
花药培养主要是使花粉改变正常发育途径而转向形成
胚状体和愈伤组织,从而产生
单倍体植株。离体胚培养有幼胚与
成熟胚培养两类,通过使用相应的培养基使离体胚正常的萌发生殖,以供研究和操作使用。原生质体的培养则是一切利用原生质体进行
遗传操作的基础,它是将取得的植物细胞去除
细胞壁形成
原生质体后进行培养,具体方法与
细胞培养有一定的相似之处。作为后继操作的基础,培养
技术的选择是非常重要的。采用适当的培养方法可以更好地进行
遗传操作和保存细胞,而错误的选择是有可能影响结果甚至导致试验和生产失败,造成时间和金钱的浪费。
改造细胞
仅仅对细胞进行培养是不够,要使培养的细胞能为人类服务,就要对其进行一定的改造,这就涉及到了细胞的
遗传操作。可以说,
遗传操作是整个细胞工程中最为重要也最具挑战性的一环。它极大的依赖于理论原理、操作技术以及设备的发展。随着
基因组学的发展,各项
基因组计划正在紧锣密鼓地进行,由于
DNA序列分析方法的革新,诸如高效
毛细管自动化测序、
DNA芯片法以及大规模平行
实测法的应用大大加快了
基因组计划的进程。
拟南芥基因组计划将于2004年完成,水稻、
番茄和玉米基因组的测序也正在进行。是类计划所提供的信息将不断定位大量有价值的基因,而最近的研究还表明影响
作物产量的可以是单基因的改变而不仅仅是
多基因决定。所有这一切的
基础研究都为
遗传操作提供了更多、更准确的理论依据。实验技术的发展则使精确、高效的
遗传操作变得更加方便。将
外源DNA导入
靶细胞的方法不断完善,除了以前经常使用的
质粒载体、
病毒载体、
转座因子和APC(
酵母人工染色体裸DNA基因枪超声波法和电
注射法等非
病毒方式转换细胞的方法也开始被广泛的使用;
细胞融合方法已被不断的改进,融合率增大;细胞诱变也取得了较大的进展,诱变方式不断增加。这些理论和技术的发展都为更好的改造细胞创造了条件。
培养或改造好的细胞是进行研究和生产的基本材料,为了使其不致死亡并尽量保持优良的特性,就需要进行适当的保藏。一般是根据细胞的特点,人工创造条件使其生长代谢活动尽量降低,处于
休眠状态,以抑制增殖和减少变异。作为世界上最大的
细胞库,
ATCC早在92年就已经有了三千两百多个
细胞系入库,而且数量还在不断增加。此外还有CSH(美)、
NCTC(英)、NRRL(英)、KCC(日)等著名的保藏机构,国内也有一些较为大型的机构,足见各国对细胞保藏的重视。由于植物细胞有其自身的特点,因而其保藏方法不可能与微生物完全相同。通常采用的方法是液氮
超低温保藏方法。这种方法利用液氮的温度可以达到-196,远远低于一般细胞新陈代谢作用停止的温度(-130℃)从而使细胞的代谢活动停止,化学作用随之消失,达到长期保藏的目的。操作时要注意从常温到低温的过渡,以使细胞内的
自由水通过膜渗出,避免其产生冰晶而损害细胞。另外还有低温
冻藏法及其他一些保藏方法,但多用于短期保藏。
目的
细胞工程的目的,是得到人们所需要的生物产品。要使已经改造好的细胞产生大量具有经济价值的产物,就必须依靠下游加工过程,也就是我们常说的
下游工程。它的作用就是
大量培养细胞,并从
培养液中分离、精制出有关的
生物化工产品。由于植物细胞的高度
易碎性,对
剪切力的敏感、细胞有
去分化和
聚集作用,增殖时间长等独特性,使其大规模培养技术明显比微生物和
动物细胞的发展缓慢。但通过不懈的努力,已经具备在2万升规模的
生物反应器中培养烟草细胞的能力。而日本的三井石化也已经在使用750L
发酵罐通过培养植物细胞而生产
紫草宁,且产量较高,可满足全日本百分之四十上的需要。相信随着理论以技术的不断完善,植物细胞的大规模的培养将会很快的成为一种常规的
生产手段。培养后的
培养物经过处理后被分离、提纯。分离和精制过程所需的费用在整个
生产过程中的占有很大的比例,一般为60%,有些甚至高达80-90%,而且还有继续加剧的取向。因此该过程的落后也可能阻碍细胞工程的发展。世界各国已经都比较重视这个问题,英国早在83年就发起了
生物分离计划(BIOSEP),专门研究分离与精制,我国也曾经召开过专门会议。分离与精制的困难是由于
培养液自身的
理化特性所决定,这就需要在上游工程时就考虑到这方面的问题,同时不断推出新的
分离纯化技术及方法,从而简化过程、
降低成本,这在实际生产中是很重要的。
应用
作物新品种的培育
2、突变体的利用