1984年英国莱斯特大学的遗传学家Jefferys及其合作者首次将分离的人源小卫星DNA用作基因探针，同人体核DNA的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因DNA指纹指纹图谱”。

1.1 高变异DNA 序列的发现

1980 年，Wyman 和 White 在进行人体DNA 基因文库的研究中，筛选到一个随机DNA 片段，以其为探针进行RFLPs 分析，检测到8 个等位基因，平均杂合率超过75%，因此推测该位点的多态性来源于DNA 重排而非碱基突变，这是人类基因组中发现的第一个高变区（hypervariable regions，简称HVRs）。此后，人们在人类基因组中又陆续发现了其他一些高变区，如α-珠蛋白基因（Higgs 等 1981，1986）、胰岛素基因（Bell 等 1982）、脂蛋白基因（Knott等 1986）、D-Ha-ras 癌基因（Capon 等 1983）、Zata-珠蛋白基因（Goodbourm 等 1983）等基因的侧翼及肌红蛋白基因（Weller 等1984）的第一个内含子区域，都含有这种HVRs。这些高变区的共同特点为：都是由一短序列（即重复单位）首尾相连、多次重复而成，其多态性来源于重复单位的重复次数不同。同一高变区的这些重复单位还具有高度的保守性，但因重复单位的重复数目不同，形成了众多的等位基因。这些高变区后来被叫做小卫星（minisatellite）（Jeffreys 等 1985a），有的人又称其为可变数目串联重复序列（variable number of tandemrepeat，简称VNTR）（Nakmura 等1987）。在小卫星DNA 内，重复单位数目的高度变异是由于不等交换所造成的，换言之，即在有丝分裂时的姊妹染色单体（sister chromatids）或减数分裂时的同源染色体间互换所致。有时候，发现DNA 链架突变的发生频率高于点突变，其频率为每世代每千个核苷酸对在10－ 5～10－ 2。虽然不等互换导致重复单位数目增加或减少，但不同重复的形成却是由于点突变造成的。此外，基因转换（gene conversion）与重组似乎在同源性的维持上扮演着重要的角色。在DNA 复制期间的滑动复制（slippage）是重复单位内简单序列 （1～4 个核苷酸对）演化的机制（Wolf 等 1989）。故有丝分裂或减数分裂时不等互换、基因转换及滑动复制，均足以导致重复单位间同源性的维持及重复单位数目的变化。大多数重复序列单位共有一个约 10～15 个核苷酸对的核心序列（core sequence），此核心序列高度地保留于相关的小卫星DNA 家族中，它是重组信号，可能是真核生物DNA 重组交换的热点，可促进小卫星DNA 的不等交换（Jeffreys 等 1985a；Wyman 等 1990）。核心序列是重复单位间序列相似的基础。在小卫星DNA 区域内，同源染色体可能有不同数目的重复单位，利用限制性内切酶可产生DNA 指纹。由此可见，串联重复序列的高度变异性与其特殊的结构密切相关。然而，基因组中此类串联重复序列的真实生物学功能至今仍不清楚。

1.2 DNA 指纹图谱的发现

1985 年，英国来斯特大学遗传系的Jeffreys（1985a）及其同事在《Nature》杂志上报道了他们对人体基因组高变区的突破性研究。他们用肌红蛋白基因第一个内含子中的串联重复序列（重复单位长33bp）作探针，从人的基因文库中筛选出8 个含有串联重复序列（小卫星）的重组克隆。经序列分析，发现每个克隆都含有一个长0.2～2.0kb、由重复单位重复3～29 次组成的小卫星DNA。尽管这8 个小卫星的重复单位的长度（16～64bp）和序列不完全相同，但都含有一段相同的核心序列，其碱基顺序为 GGGCAGGAA。他们用 16bp 重复单位（主要为核心序列）重复29 次而成的小卫星33.15做探针，与人基因组酶切片段进行Southern 杂交，在低严谨条件下杂交产生由10 多条带组成的杂交图谱，不同个体杂交图谱上带的位置是千差万别的。随后他们用另外一个小卫星探针33.6 进行测试，获得了类似的图谱。这种杂交图谱就像人的指纹一样因人而异，因而Jeffreys（1985b）等人称之为DNA 指纹图谱（DNA finger print），又名遗传指纹图谱（genetic finger print）。产生DNA 指纹图谱的过程就叫做DNA 指纹分析（DNA finger printing）。

1.3 DNA 指纹图谱的特点

DNA 指纹图谱具有以下3 个基本特点：

（1）多位点性：基因组中存在着上千个小卫星位点，某些位点的小卫星重复单位含有相同或相似的核心序列。在一定的杂交条件下，一个小卫星探针可以同时与十几个甚至几十个小卫星位点上的等位基因杂交。一般来说，一个DNA 指纹探针（又称多位点探针）产生的某个个体DNA 指纹图谱由10～20 多条肉眼可分辨的图带组成。由于大部分杂合小卫星位点，仅一个等位基因出现在图谱的可分辨区内（两个等位基因由于重复单位、重复次数不同，在长度上差异很大），因而每条可分辨图带代表一个位点。很多的研究表明，个体DNA 指纹图谱中的带很少成对连锁遗传，所代表的位点广泛地分布于整个基因组中（Burke 等1987；Hiu 等1985）。一个传统的RFLPs 探针一次只能检测一个特异性位点的变异性，所产生的图谱一般由l～2 条带组成，仅代表一个位点。因此两者比较而言，DNA指纹图谱更能全面地反映基因组的变异性。

（2）高变异性：DNA 指纹图谱的变异性由两个因素所决定，一是可分辨的图带数，二是每条带在群体中出现的频率。DNA 指纹图谱反映的是基因组中高变区，由多个位点上的等位基因所组成的图谱必然具有很高的变异性。DNA 指纹图谱在个体或群体之间表现出高度的变异性，即不同的个体或群体有不同的DNA 指纹图谱。一般选用任何一种识别4 个碱基的限制性内切酶，这种变异性就能表现出来。Jeffreys 等 （1985b）对人的DNA 指纹图谱的研究表明，DNA 指纹图谱中的大部分谱带都以杂合状态存在，平均杂合率大于70%，某些大片段的杂合率甚至高达100%。用探针33.15 进行DNA 指纹分析时，发现两个无血缘关系的个体具有相同DNA 指纹图谱的概率仅为3× 10－11；而将探针33.15 和33.6 产生的DNA 指纹图谱综合起来分析时，则这种概率为5×10－19，可见DNA 指纹图谱具有高度的个体特异性。但是，同卵双胞胎的DNA 指纹图谱是相同的，因其有完全相同的基因组（Hiu 等1985）。值得注意的是，由于琼脂糖凝胶电泳分辨率的限制，DNA 指纹图谱大片段区域的变异性往往很高，而小片段区域的变异性则很低，因此在实际操作时往往将小于 2kb 的小片段跑出胶外或不作统计。

（3）简单而稳定的遗传性：Jeffreys 等（1985a）通过家系分析表明，DNA 指纹图谱中的谱带能够稳定地从上一代遗传给下一代。子代DNA 指纹图谱中的每一条带都能在其双亲之一的图带中找到，而产生新带的概率（由基因突变产生）仅在0.001～0.004 之间。DNA 指纹图谱中的杂合带遵守盂德尔遗传规律，双亲的各图带平均传递给50%的子代。DNA 指纹图谱还具有体细胞稳定性，即用同一个体的不同组织如血液、肌肉、毛发、精液等的DNA 做出的DNA 指纹图谱是一致的（Gill 等1985），但组织细胞的病变或组织特异性碱基甲基化可导致个别图带的不同。

1.4 DNA 指纹图谱的应用

由于DNA 指纹图谱具有多位点性、高变异性、简单而稳定的遗传性，因而自其诞生就引起了人们的重视，表现出巨大的实用价值。DNA 指纹图谱的高变异性和体细胞稳定性可用于鉴定个体，这对法医学上鉴别犯罪分子和确定个体间的血缘关系极有价值（Jeffreys 等1985b，1985c）。如我国公安部利用DNA 指纹图谱已侦破数百例疑难案件。其简单的遗传性可用来鉴定亲子关系，其多位点性可用来检测目标基因组的病变及治疗等过程中的改变情况。1987 年Burke、Jeffreys 和Wetton 等报道了用人源核心序列小卫星探针33.6 和33.15 检测到哺乳动物到鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼、昆虫等的高变异小卫星，产生具有个体特异性或类群特异性的DNA 指纹图谱。1988 年，Dallas 用人源小卫星探针33.6 获得了水稻的DNA 指纹图谱。随后，美国华盛顿大学生物系Nybom 等人对果树植物的DNA 指纹图谱进行了大量的研究。1989年，Braithwaite 和Manners 首次将人源小卫星探针33.6 和33.15 用作真菌的DNA 指纹分析获得了成功，从而进一步证明DNA 指纹技术具有广泛的适用性。这些发现使DNA 指纹图谱成为研究动植物群体遗传结构、生态与进化、分类等很有价值的遗传标记。

1.5 DNA 指纹图谱的研究进展

1.5.1 DNA 指纹分析的探针

两个最早的DNA 指纹探针是1985 年Jeffreys 及其同事所发现的人源小卫星探针33.6 和33.15（Jeffreys 等 1985a）。1987 年，Vassart 等发现无外源DNA 片段的细菌噬菌体M13 本身就能够作为一个DNA 指纹探针检测出人和动物基因组中的高变异小卫星DNA，其有效序列是蛋白质 Ⅲ 编码区内的两个小卫星序列。从此，M13 便也成为各种动植物重要的DNA 指纹探针（Gatei 等 1991；Kuhnlein 等 1989）。另一个在人和动物上广泛应用的 DNA 指纹探针是3´HVR（Jarman 等 1986），它来源于人α-珠蛋白的3´端的一个高度重复区。以上4 个小卫星探针的重复单位的序列结构如下所示：

33.6（AGGGCTGGAGG）3

33.15（AGAGGTGGGCAGGTGG）

M13（GAGGGTGGNGGNTCT）

3´HVR（GNGGGGNACAG）

从迄今已有的报道来看，在DNA 指纹分析中用得最多的多位点小卫星探针为33.6、33.15、M13 及3´HVR。此外，人们还从某些动物的基因组中分离克隆了一些小卫星DNA 用作DNA 指纹探针。如牛的小卫星探针PSRC-7（ Plante 等 1991）和猪的小卫星探针pS35（Coppieters 等 1990）。人工合成的简单重复序列微卫星探针也广泛地用于DNA 指纹分析，如（GTG）5 、（TG）8、（AT）8、（TCC）5 、（GACA）4。从基因组中分离克隆的微卫星DNA 指纹探针有PGB725 （牛）（Kashi 等 1990）和 R18.1 （猪）（Haberfield 等 1991）。 孟安明（1993）发现，任何一个动物个体的基因组总DNA 可标记作为DNA 指纹探针（基因组探针），在该个体所属物种及其他相关物种上产生具有个体特异性的杂交图谱。以基因组探针进行DNA 指纹分析不需通过复杂的操作来获得探针DNA，有利于DNA 指纹技术的推广。

1.5.2 DNA 指纹图谱的重要发展

DNA 指纹图谱的重要发展是微卫星DNA 指纹图谱。微卫星（microsatellite）是由2～6 个核苷酸组成的重复单位串联排列而成的DNA 序列。据估计，在真核生物基因组每10kb 的DNA 序列中至少有一个微卫星（Tautz 1989），如人体基因组中仅二核苷酸串联重复的微卫星就多达 50 000～100 000 个。大多数微卫星的长度小于 200bp，但也有更长的微卫星。微卫星不同于小卫星，它们广泛分布于很多结构基因的内含子、基因间隔区甚至调控序列中（Tautz 等 1984；Weising 1989；Ishii 等 1985）。早在1974 年，Skinner 等就在寄居蟹（hermit crab）基因组中发现了微卫星DNA，当时叫做简单串联重复序列（simple tandem repeat）。Singh 等人在1980 年发现蛇的W 性染色体上也存在着这种序列，它是由GATA/GACA 重复单位组成的。以后的研究表明，在真核生物甚至原核生物的基因组中都普遍存在这种序列（Jones 等 1981；Tautz 等 1986）。直到1986 年，Ali 等人首次用合成的GATA/GACA 寡聚核苷酸作探针用于人的DNA 指纹分析，成功地开创了利用微卫星DNA 探针进行DNA 指纹分析这一新的领域。微卫星探针易于合成，可直接与固定在干胶中的DNA 片段杂交，所检测的位点普遍具有高度的变异性。1988 年，Schafer 等人进一步发展了这门技术，使寡聚核苷酸（微卫星）分析技术又一次得到了完善。迄今为止，合成的各种寡聚核苷酸（微卫星）已成功地应用于人和近百种动植物的DNA 指纹分析（Buitkamp 等 1991a，1991b；Schafer 等1988；May 等 1991；Nuraburg 等 1989；Hubert 等 1990；Lonn 等1992；Biermerth 等 1992；Caetano-Anolles 等 1991）。从已有的报道来看，适用范围广、变异性高的微卫星探针主要有（GTG）n、（GT）n、（GATA）n、（GACA）n、（GAG）n 等（Buitkamp 等1991a，1991b）。

1.5.3 PCR 在DNA 指纹分析中的应用

PCR 是一种在体外大量扩增DNA 的方法。在法医研究上，由于所检验的材料量（如血斑、精斑、发梢）极微，因此很难获得常规Southern 杂交所需的DNA 量，利用PCR 就可以解决这一问题。Jeffreys 等（1988）根据多个小卫星的已知侧翼序列来合成引物（每个小卫星两个引物）。先以极微量（ 甚至单个细胞 ）的人类基因组DNA 为模板进行体外扩增（产物可长达10kb），然后再用这些小卫星的混合探针进行Southern 杂交，得到了可以重复做出的具有高度变异性的DNA 指纹图谱。

1.5.4 单位点高变异性小卫星和微卫星探针的开发

DNA 指纹图谱虽然具有很多的优点，但并非完整无缺。第一，DNA 指纹图谱中每一个个所含图带数很多，给统计分析带来了许多麻烦。例如，在比较个体之间的DNA 指纹图谱时，如果某两条带的位置相差很小，那么就很难判断它们是否来自同一位点上的同一等位基因，也许是由于实验操作过程中凝胶变形等引起的误差影响了分析结果的准确性。第二，DNA 指纹图带的分辨率很难提高，特别是较小的DNA 片段因难以分开而呈现很低的变异性；长度相差不大的DNA 片段无法通过电泳分开。第三，DNA 指纹图谱不能区分杂合体和纯合体。在进行DNA 指纹图谱统计分析时，人们假定图中每一条带分别代表不同的位点，但实际上，如果某一位点是杂合的，那么此位点在DNA 指纹图谱上会拥有两条带，也就是说在DNA 指纹图谱上应有两条带代表同一个杂合位点上的不同等位基因。因此，有时以DNA 指纹图谱分析得到的结果与真实情况也会有所不同。第四，对于某一个位点来说，往往只有一个等位基因出现在DNA 指纹图谱上，因此无法根据DNA 指纹图谱确定个体在该位点上的基因型。为了克服DNA 指纹图谱的上述缺点，人们已开始重视单位点探针的开发。所谓单位点探针，是指只是特异性与某一位点上的等位基因杂交的探针。由于真核基因组中的小卫星和微卫星位点普遍具有高度的变异性，因此它们是高变异单位点探针的重要来源。基因组中的小卫星位点有数千个，微卫星位点更达数十万个，通过用现有的多位点小卫星和微卫星探针筛选基因文库，可以得到众多的高变异单位点探针。迄今为止，国外一些单位已从猪、马、鸡、牛等的基因组中分离、克隆了数百个小卫星和微卫星探针，这些探针将是构建有关畜禽基因图谱的基础。

1.5.5 其他方面的进展

双向电泳（two-dimensional electrophoresis）的应用，使 DNA 指纹图谱的容量大大增加（Uitterlinden 等 1989）。变性凝胶电泳可以更有效地分辨等位基因（Uitterlinden 等1989）；电极反转电泳（field inversion gel electrophoresis）提高了 DNA 指纹图谱中大片段的分辨率（Fowler 等 1988）。由于DNA 指纹图谱在实验技术和统计方法上一直处于不断的改进之中，因此我们深信在不远的将来，DNA 指纹分析技术必将在医学、畜牧业、农业乃至整个生物领域得到更加广泛的应用。

2.1 主要试剂及器材

产生 DNA 指纹图谱的主要试剂及器材如下：限制性内切酶 HinfⅠ、HaeⅢ等；电泳级琼

脂糖；尼龙膜；λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ；H4 型（24×20cm）水平电泳槽装置；Model 250 型

电泳仪；标记试剂盒 Prime-a-Gene® Labeling system；（α-32P）dCTP；X 光胶片；LS5801

型液闪仪；FYY-1 型多功能生化反应仪。

2.2 有关试剂的配制

（1） ACD 抗凝剂

柠檬酸 0.48g

柠檬酸钠 1.32g

葡萄糖 1.47g

加水至 100ml

（2） T10E10 缓冲液

Tris-HCl 10mmol/dm3

EDTA 10mmol/dm3

pH 值：8.0

（3）TE 缓冲液

Tris-HCl 10mmol/dm3

EDTA 1mmol/dm3

pH 值：8.0

（4）20%SDS（100ml）

SDS 20g

溶于 100ml 蒸馏水中，30℃以上贮存。

（5）USSTE 裂解液

Urea 8mmol/dm3

NaCl 0.3mol/dm3

SDS 2%

Tris-HCl 150mmol/dm3

EDTA 1mmol/dm3

pH 值：7.5

（6）Tris 饱和酚

新蒸苯酚加入 8-羟基喹啉至终浓度为 0.1%，用 1mol/dm3 Tris-HCl 和0.5mol/dm3

Tris-HCl 溶液饱和至 pH 值 8.0，去掉上层水相，加适量（约 1/10 体积）的 0.1mol/dm3 Tris-HCl

（pH 值8.0）覆盖在酚相上，保持4℃，放在棕色瓶中保存。

（7）50×TAE 缓冲液（1 000ml）

Tris 242g

冰醋酸 57.1ml

0.5mol/dm3 EDTA（pH 值 8．0） 100ml

（8）10× BPB 贮存液

聚蔗糖 20%

EDTA 0.2mol/dm3

溴酚蓝 0.25 %

二甲基腈蓝 0.25%

本贮存液可在室温存放。

（9）40mmol/dm3 亚精胺

亚精胺 0.58g

将亚精胺溶于 10ml 蒸馏水中，4℃下存放。

（10）溴化乙锭（EtBr）贮存液 （10mg/ml）

EtBr 1g

将EtBr 溶于 100ml 蒸馏水中，在棕色瓶存放，温度保持在 4℃。

（11）变性液

NaCl 1.5mol/dm3

NaOH 0.5mol/dm3

（12）20×SSC（1 000ml）

NaCl 175.3g

柠檬酸钠 88.2g

用 10mol/dm3 NaOH 调 pH 值至 7．0，高压灭菌。

（13）杂交液

NaPO4 0.5mol/dm3

SDS 7 %

EDTA 1mmol/dm3

（14）标记反应终止液

聚葡萄糖蓝 0.9%

溴甲酚紫 0.03%

EDTA 20mmol/dm3

4℃下存放。

（15）SephadexG-50 的水化

SephadexG-50 10g

将 SephadexG-50 溶于约 300ml TE（pH 值 8．0）中，高压灭菌，4℃下存放。

（16）闪烁液（500ml）

无水乙醇 10ml

PPO 2g

PoPoP 50mg

二甲苯 490ml

室温棕色瓶存放。

2.3 操作步骤

2.3.1 基因组DNA 的提取

（1）10ml 全血与 40mlT10E10 缓冲液混匀，4 000r/min 离心10 分钟。

（2）弃上清液，在沉淀中加入 40mlT10E10 缓冲液混匀，4 000r/min 离心 10 分钟。

（3）弃上清液，在沉淀中加入 40mlTE 缓冲液混匀，4 000r/min 离心 10 分钟。

（4）弃上清液，在沉淀中加入10mlUSSTE 裂解液，混匀呈浊液，置摇床过夜，温度保持

在37℃。

（5）加入 10ml 苯酚，缓慢上下混匀至少 20 分钟，4 500r/min 离心 20 分钟。

（6）用移液枪小心地将上层水相转移到另一离心管中，吸头的尖端剪去一小段，以免在

吸取过程中损伤大分子DNA。

（7）向水相中加入等体积的酚、氯仿、异戊醇（体积比为24:23:1），缓慢上下混匀15

分钟，4 500r/min 离心20 分钟。

（8）如前述吸出水相，向水相中加入等体积的氯仿、异戊醇（23:1），上下缓慢混合10

分钟，4 500r/min 离心 20 分钟。

（9）吸出水相，向水相中加入2 倍体积的预冷（—20℃）无水乙醇，盖紧管盖，上下颠

倒即可看见白色絮状DNA。

（10）小心将絮状DNA 吸（吸头尖端剪去一小段，端部必须光滑）至1 .5ml 离心管中，加

入 1ml 70%的乙醇，来回颠倒数次离心管，10 000r/min 离心 2～5 分钟。

（11）小心地倒掉管中乙醇，将管倒置在干净的吸水纸上，以让乙醇流尽。

（12）将离心管正立，置45℃烘箱中烤20 分钟左右，以便让乙醇完全挥发掉，如有条件，

可置于真空干燥器中抽气10 分钟。

（13）取出离心管，视沉淀块的大小加入 100～200μl TE 缓冲液，置55℃水浴中过夜，以

溶解 DNA。

（14）将溶解后的 DNA 置于 4℃或—20℃下贮存。

2.3.2 基因组DNA 的酶切

（1）每样酶切反应为：

10μg DNA

1.5ml（15u） 限制性内切酶

6μl 10 倍 buffer

6μl 40mmol/dm3 亚精胺

加双蒸水至体积为60μl，用吸头混匀。

（2）37℃水浴，保持6～8 小时。

（3）取出酶切样品置于4℃下。

2.3.3 基因组DNA 酶切情况检查

（1）从每个酶切样品中取出3μl 消化液，加入3μl 2 倍BPB 混匀后点样。

（2）用 0.8%琼脂糖凝胶（内含 0.5μg/ml EtBr）和 1 倍TAE 缓冲液进行电泳，电压为60V。

（3）1 小时后，在紫外灯下检查酶切是否完全及各样品的DNA 浓度是否一致，以确保每个样品进行电泳时上样量一致。

（4）如果发现某个样品酶切不完全，则另外加入5μl 左右的酶，在37℃条件下水浴保温6 小时。

（5）已完全酶切的样品，加入1/10 体积（6μl）的电泳上样缓冲液（10 倍BPB），混匀后置4℃（短期）或—20℃（长期）保存。

2.3.4 大板凝胶的制备和电泳

（1）称取3.75g 琼脂糖，将其倒入一个500ml 容积的普通试剂瓶（透明度要高）中。用蒸馏水将50 倍TAE 贮存液稀释成1 倍TAE， 量取375ml 1 倍TAE 加入瓶中， 配制的凝胶浓度为 1.0% 。

（2）盖上瓶盖，但不能旋得太紧。将瓶放入微波炉中加热，待琼脂糖完全熔化后，溶液是透明的。

（3）取出瓶子放在55℃的水浴箱中，约30 分钟后就能冷却至55℃。

（4）洗净并擦干制胶板（24cm ×22cm），用 2cm 左右宽的透明胶布将制胶板的两个开口端封牢，放置在水平台面上用水平仪调平。将样品梳（ 6mm × 3mm ）插入制胶板离最近开口端 2cm 位置。将冷却至55℃的凝胶摇匀，缓慢地倒入制胶板中央，如果有气泡出现，应用吸头将气泡吸掉，60 分钟后，制胶板中的凝胶将完全凝固。

（5）将 50ml 50 倍 TAE 贮存液倒入电泳槽中，再加入 2 450ml 蒸馏水与其混匀，电泳槽也应置于水平台面上。

（6）将制胶板两端的透明胶布剥离，然后将制胶板放在电泳槽的中部，小心地拔出加样梳，以免加样孔破裂。

（7）从 4℃冰箱中取出 DNA 样品，另取两个离心管，各加入 12μl（1μg/8μl）的分子量标志物λDNA/EcoRⅠ+Hind Ⅲ 及 1/10 体积的（1.2μl）10 倍 BPB，混匀。将 DNA 样品及分子量标记物一起置于55℃水浴箱保温10 分钟，取出后立即置于冰水混和物中，2～3 分钟后点样，这样可防止粘性末端之间的粘接。

（8）加样时每个样品用一个吸头，以免交叉污染。吸出样品后应迅速插入加样孔中下部，轻轻推出样品，在两端加样孔中各点入分子量标志物。

（9）盖上电泳槽盖，插上导线，在加样后5 分钟接通电流，以留出时间使加样孔内的样品通过扩散而均匀分布，将电压调至30V，电泳60 小时。2.3.5 Southern 转移

（1）电泳结束后，将制胶板连同凝胶一起放在一个方形塑料盘中，倒入约350ml（浸没凝胶）的 0.2mol/dm3HCl 处理 25 分钟，并每过约5 分钟摇动一次。

（2）倒掉稀盐酸溶液，加入蒸馏水简单地洗涤一下凝胶，然后倒掉蒸馏水，加入约350ml的变性液浸泡30 分钟，间断性地摇动。

（3）倒掉变性液，加入350ml 0.5 倍变性液浸泡 25 分钟，间断性地摇动。

（4）将制胶板连同凝胶一起取出，将一块约28cm×19.5cm 的玻璃板盖在凝胶上，极其小心地将制胶板倒翻过来，这时玻璃板在下，凝胶在上，轻轻地滑出制胶板，将玻璃板连同其上的凝胶放在水平的桌面上。

（5）将一张20cm×19cm 的尼龙膜（注明样品排列方向及电泳方向）在0.5 倍变性液中浸湿，然后对齐凝胶小片段区域的顶端将尼龙膜铺在凝胶的表面，用一根玻璃棒从膜的表面推过以赶走膜与凝胶之间的气泡，用墙纸刀切除掉凝胶的无用部分（未被尼龙膜覆盖住的部分）。操作时应戴上手套或用镊子。

（6）将3 张稍大于膜的滤纸（20cm×20cm）依次在 0.5 倍变性液中浸湿，放置在膜上，每放一张滤纸后都应用玻璃棒轻轻赶走气泡。

（7）将一打（约4～5cm 厚）已裁至滤纸大小的干吸水纸放在滤纸层上，再将一块玻璃板放在吸水纸上，然后抓紧上下两块玻璃板迅速翻转放在水平桌面上，抽去凝胶上面的玻璃板。

（8）在凝胶的四周露出的滤纸及吸水纸上放上保鲜膜，以防止凝胶上下的滤纸直接接触。然后将 5 张稍大于凝胶的滤纸（20cm ×20cm）依次在 0.5 倍变性液中浸湿，放置在膜上，每放一张滤纸后都应用玻璃棒轻轻赶走气泡。

（9）用一层保鲜膜将整个转移装置围盖住，以防水分蒸发，将一块玻璃板压在顶部。

（10）持续转移3～4 小时后，去掉上面的滤纸和凝胶，取下尼龙膜放在2 倍SSC 中浸泡20 分钟，间断性摇动，然后取出放在一张干净的滤纸上，置60℃烘箱中烘30 分钟，使DNA固定于尼龙膜上。

（11）将烤干的膜夹在两张干燥滤纸之间，置于室温下保存待用。

2.3.6 探针的标记

（1）将80ng 探针DNA（体积 ＜ 30μl）倒进一个新的0.5ml 离心管中，在沸水中煮5～10分钟，取出，插入碎冰中。

（2）然后依次在试管中加入下列成分：10μl 5 倍标记缓冲液（含随机引物），2μl BSA（10mg/ml），2μl dATP、dGTP、dTTP 等量混合物（浓度为各 20μmol/dm3）；30μl 灭菌蒸馏水，50μl（α-32P）dCTP（10μCi/μl，3 000Ci/mmol）（至浓度为 333nmol/dm3）；lμl Klenow酶（3u/μl）；最后体积为 50μl。

（3）将全部试剂混匀后置37℃保温壶中保温6 小时。

（4）加入等体积（50μl）的标记反应终止液终止反应。

2.3.7 未掺入核苷酸前体的除去

（1）取一0.5ml 离心管，在管底部打一小孔，用玻璃棉塞住小孔，外套一个1.5ml 离心管。

（2）向0.5ml 的管中加满TE 饱和的Sephadex G-50。

（3）3 000r/min 离心 5 秒钟，重新加满Sephadex G-50 后再离心，直到 Sephadex G-50加满0.5ml 小管的3/4。

（4）将标记反应液加入 0.5ml 管中，3 000r/min 离心数秒钟。

（5）将1.5ml 管中的液体（蓝色）移入另一1.5ml 离心管中。

（6）向0.5ml 管中加入 40μl TE，3 000r/min 离心数秒钟。

（7）重复（5）、（6）步骤2～3 次，直到凝胶中的紫色即将到达0.5ml 管底部。

（8）将回收的探针置于4℃下待用。

2.3.8 探针放射性强度的测定

（1）取两个液闪瓶，各加2ml 闪烁液。

（2）在其中一个液闪瓶内加入2μl 原标记反应液。

（3）在另一个液闪瓶内加入2μl 去除了未掺入核苷酸的回收液。

（4）将2 个液闪瓶置于液闪仪中，测定其cpm。

2.3.9 Southern 杂交

（1）将 25ml 杂交液放入方形塑料盒中，于 55℃下预热。

（2）将待杂交的膜和杂交液一起放入水浴摇床中。

（3）在55℃下预杂交1.5 小时左右。

（4）将放射性探针放在沸水中5 分钟，取出后迅速插入冰水中。

（5）在杂交液中按5×105cpm/ml 的浓度加入变性的探针。

（6）在55℃下杂交约15 小时。

（7）将杂交液中的膜取出，放入1 倍SSC 溶液中于55℃下漂洗10 分钟。

（8）倒去1 倍SSC 溶液，在55℃下用1 倍SSC 溶液及0.1 %SDS 洗脱液漂洗40 分钟。

（9）倒去洗脱液，55℃下用新的1 倍SSC 溶液及0.l%SDS 洗脱液漂洗30 分钟。

（10）将膜放入1 倍SSC 溶液中，于室温下漂洗10 分钟。

（11）取出膜，平摊在洁净、干燥的滤纸上。

（12）当膜上无水珠、膜仍湿润时，用保鲜膜将膜包好准备压片。

2.3.10 放射自显影

（1）在暗室或微弱安全光条件下，打开X 光曝光暗盒。

（2）放入一张增感屏，光滑面朝上。

（3）将膜放在增感屏上（膜与膜之间不能重叠）。

（4）置X 光胶片于膜上。

（5）将另一张增感屏光滑面朝下放在X 光胶片上。

（6）盖紧X 光暗盒，置—70℃冰箱内曝光1～7 天。

2.3.11 X 光胶片的冲洗

（1）显影：将X 光胶片从暗盒中取出，放入显影液中，间断性摇动数分钟。

（2）停显影：将X 光胶片放入1.5%的冰醋酸溶液中漂洗数秒钟。

（3）定影：将X 光胶片转入定影液中定影数分钟。

（4）冲洗：将定影完毕的X 光胶片放在流水中冲洗20 分钟，然后晾干。

2.3.12 放射性探针的除去

（1）将300～500ml 蒸馏水煮沸。

（2）往蒸馏水中加SDS，至最终浓度0.l%。

（3）将放射自显影后的膜浸入其中。

（4）待冷却至室温时将膜取出、烘干，即可用于另一种探针的杂交。

3.1 分析范围及标准

所有图带分析均在X 光胶片上进行，所分析的图带大小范围为 2.0～23.0kb。胶片上那些位置相同（即分子量相同）、显影强度基本一致的图带被看作是完全相同的带。将同一胶片上的个体两两配对比较，找出相同的图带。在分析过程中，假定所有相同的带均来自同一位点上的同一等位基因。

3.2 DNA 指纹图谱的共有带率

（Band-sharing，简称BS）BS 的计算公式为：

BS=2NAB/（NA +NB ）

式中：NA 指个体A 的图带数，NB 为个体B 的图带数，NAB 指个体A 和个体B 共有的图带数。

3.3 平均等位基因频率及最低平均杂合率

平均等位基因频率（q）及最低平均杂合率（Ht）

计算公式为：

q =l—（1—BS）1/2，Ht=l—q

式中BS 为共有带率。

3.4

两个个体具有完全相同的DNA 指纹图谱的概率（P）两个无关个体具有完全相同的DNA 指纹图谱的概率为：P1 = （1—2BS+2BS2 ）n/BS ；两个同胞个体具有完全相同的DNA 指纹图谱的概率为：P2 =[1—0．5q（1—q）2（4—q）]n/BS。式中：n 为个体的平均图带数，q 为平均等位基因频率。

3.5

一个探针可能检测到的位点总数 （N）和可检测到的不同位点数（L ） 的估计计算公式为：

N = [（n —b）（n —b － 1）/2a 十 1]/2；L =n －a —b

式中：n 为可见带数，a 为等位位点数，b 为连锁位点数。

3.6

DNA 指纹图带的家系遗传分析根据孟德尔遗传规律，可以假定每一条只在一个亲本上存在的图带（杂合带），遗传给后代的概率为0.5（小卫星位点之间没有连锁和突变）。一个亲本的所有杂合带在子代中出现的次数符合二项式分布，对二项式分布进行适合性检验，即可判定这些杂合带是否符合孟德尔遗传规律。

卡方的计算公式为：

X2 = Σ[（O—E）2/E]

式中：O 为观察到的杂合带出现的次数，E 为期望次数（二项式对应的每一项概率乘以总次数）。自由度df =N—l。

传递率的计算方法为亲本DNA 指纹图谱中每一条带在所有后代中出现的次数与后代个体数之比的算术平均值。