1619年(万历四十七年),中进士,以二甲第五十九名赐
进士出身。此后历任南京兵部主事、兵部郎中、太原知府、山东按察使右参政等职。
1641年(崇祯十四年),杨嗣昌去世,丁启睿升任兵部尚书,改称督师,又总督湖广、河南、四川及长江南北诸军,仍兼总督陕西三边军务。崇祯帝赐给丁启睿
尚方剑、
飞鱼服及印信。丁启睿受命出
潼关,准备赴
荆州接管杨嗣昌的军队。湖广巡按汪承诏却传檄称有贼寇在河南,荆州、襄阳不需要大军,把汉水的船只全部藏起来,不让丁启睿渡江。丁启睿转而到了
邓州,邓州人关闭城门,不接纳丁启睿;丁启睿去
内乡,内乡长吏断了他们的粮。丁启睿的军队只能靠杀掉战马与野草一起充饥。
当时
李自成义军聚精兵数千,老弱妇孺众数万围攻
开封,丁启睿害怕,不敢援助开封,听说
张献忠在光山、固始一带,军队很少,就跟诸将商量说:“皇上命我剿杀河南的贼寇,张献忠就是河南的贼寇。”就传檄令
左良玉破
麻城,击败张献忠一部,斩首一千二百人。开封告急,丁启睿则说:“我正与张献忠激战,不能去开封。”
傅宗龙准备入关督秦师,丁启睿就乞求崇祯皇帝更改敕书,命令傅宗龙去攻打李自成。九月,傅宗龙败死于
项城。李自成乘胜攻陷
南阳,杀了唐王。十二月,李自成再围开封,河南巡抚
高名衡急请丁启睿出兵,此时丁启睿身在
许昌,而起义军正在攻打许昌,丁启睿才开始奔赴开封。在离开许昌城三十里时,许昌就被攻破。丁启睿害怕李自成部队攻打,偷偷溜进开封,李自成部队顺势攻击,开封差一点就失守。总兵
陈永福射中李自成左眼,开封之围得解。
1642年(崇祯十五年)四月,李自成第三次围攻开封,六月,崇祯皇帝任命
侯恂督援剿诸军以救开封。侯恂还未至,开封之围更加急迫。崇祯皇帝连发了数道诏书责令丁启睿保卫开封,丁启睿才不情愿地调集
左良玉、
虎大威、
方国安以及保定总督
杨文岳等部援救开封。七月,各部共十余万明军在
朱仙镇会师。李自成率闯曹联军步兵十万、骑兵三万自开封解围南下,抢先占领朱仙镇,并进一步占据上游有利地势,切断官军水源。丁启睿想尽快开战,左良玉认为起义军锋芒正盛,不能攻打,丁启睿不听。明军数战不利,左良玉违令带兵夜奔
襄阳。丁启睿与杨文岳逃奔
汝宁,李自成部队追击了400余里,明军死伤无数,丁启睿的敕书、尚方剑、印绶全部丢失。崇祯皇帝大怒,将丁启睿革职。九月,开封被黄河淹没,李自成退兵,崇祯皇帝才给他个小官当,后来又被释放回原籍。
1644年(明崇祯十七年、清顺治元年),李自成攻陷北京,崇祯皇帝自缢,明朝灭亡,福王
朱由崧在丁启睿伯父
丁魁楚等人的拥立下即位于南京,改元
弘光,史称
南明。丁启睿依附
马士英,得以总督河南,负责劝农、剿寇事务。他在任上擒斩李自成任命的
归德府官员,官拜兵部尚书,加封太子太保,并为其一子授予官位。