纳米金即指金的微小颗粒,其直径在1~100nm,具有高
电子密度、介电特性和
催化作用,能与多种
生物大分子结合,且不影响其
生物活性。由
氯金酸通过还原法可以方便地制备各种不同粒径的纳米金,其颜色依直径大小而呈红色至紫色。
发展历史
自从16世纪欧洲现代化学的奠基人、杰出的医师、化学家Paracelsus制备出“饮用金”用来治疗精神类疾病以来,纳米金就开始登上了科学的舞台。1857年英国科学家法拉第在研究道尔顿的理论时,利用
氯化金还原出含纳米金的溶液,发现在其中加入少量
电解质后,可使溶液由
红宝石色变为蓝色,并最终凝集为无色,而加入
明胶等
大分子物质便可阻止这种变化。尽管当时并不知道原因,但他的发现为纳米金的应用奠定了科学基础。1885年
纳米金溶液在美国常作为治疗
酗酒的主要成分;1890年Koch医生发现
结核杆菌不能够在金的表面存活;1890年纳米金被用来治疗
关节炎;1935年
芝加哥外科专家Edward等人发现纳米金溶液能有效的减轻患者病痛,强健体质。1939年Kausche和Ruska用
电子显微镜观察金颗粒标记的
烟草花叶病毒,呈高
电子密度细
颗粒状。1971年Faulk和Taylor首次采用
免疫金染色(immunogold staining,IGS)将兔抗
沙门氏菌抗血清与纳米金颗粒结合,用直接
免疫细胞化学技术检测沙门氏菌的表面抗原,开创了纳米金
免疫标记技术。
检测技术发展
作为现代四大
标记技术之一的纳米金标记技术(nanogold labelling techique),实质上是
蛋白质等高分子被吸附到纳米金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是纳米金颗粒表面
负电荷,与蛋白质的
正电荷基团因
静电吸附而形成牢固结合,而且吸附后不会使
生物分子变性,由于金颗粒具有高
电子密度的特性,在金标
蛋白结合处,在显微镜下可见黑褐色颗粒,当这些标记物在相应的配体处大量聚集时,肉眼可见红色或粉红色斑点,因而用于定性或半定量的快速
免疫检测方法中。由于球形的纳米金粒子对蛋白质有很强的吸附功能,可以与
葡萄球菌A蛋白、
免疫球蛋白、毒素、
糖蛋白、酶、
抗生素、激素、
牛血清白蛋白等非
共价结合,因而在
基础研究和实验中成为非常有用的工具。
1978年,Geobegan等将纳米金
标记抗体用于普通光镜下检测B淋巴细脑表面
膜免疫球蛋白,建立了光镜水平的
免疫金染色(immunogold staining,IGS)。1981年 Danscher用银显影方法增强金颗粒的
可见度,并提高了灵敏度。Holgate等人于1983年建立了用银
显影液光镜下金颗粒的可见性的
免疫金银染色法(immunogold-siliver staining,IGSS),利用银的
增强作用,加大单独金粒子在光镜下可视粒子的半径,增加了小颗粒金粒子的标记密度,提高了灵敏度。1986年Fritz等人又在IGSS法基础上成功地进行了彩色IGSS法,使得结果更加鲜艳夺目。尽管如此,由于亚硝酸银化合物是
光敏性的,需要在暗室里进行标记,
实验操作非常的不便,改用非光敏的
醋酸银化合物,价格又过于昂贵,所以纳米金在光镜中的应用日渐减少。而利用纳米金的高
电子密度,能在电镜下清晰的分辨颗粒,作为在
透射电镜(
TEM)、
扫描电镜(sEM)和
荧光显微镜的示踪物在电镜
免疫化学和
组织化学中得到了广泛应用。
应用于均相溶胶颗粒免疫测定技术
均相溶胶颗粒
免疫测定法(sol particle
immunoassay, SPIA)是利用免疫学
反应时金颗粒凝聚导致颜色减退的原理,将纳米金与抗体结合,建立微量
凝集试验检测相应的抗原,如
间接血凝一样,用肉眼可直接观察到凝集颗粒。已成功地应用于PCG的检测,直接应用
分光光度计进行定量分析。
应用
荧光素标记的抗体,通过
流式细胞仪(Flow CytoMeter,
FCM)计数分析
细胞表面抗原,是免疫学研究中的重要技术之一。但由于不同荧光素的光谱相互重叠,区分不同的标记很困难。Boehmer等研究发现,纳米金可以明显改变
红色激光的
散射角,利用纳米金标记的羊抗鼠Ig抗体应用于
流式细胞术,分析不同类型细胞的
表面抗原,结果纳米金标记的细胞在波长632nm时,90度散射角可放大10倍以上,同时不影响细胞活性。而且与
荧光素共同标记,彼此互不干扰。因此,纳米金可作为多参数细胞分析和分选的有效
标记物,分析各类
细胞表面标志和细胞
内含物。
斑点免疫金银
染色法(Dot-IGS,IGSS)是将斑点
ELISA与免疫纳米金结合起来的一种方法。将蛋白质抗原直接
点样在
硝酸纤维膜上,与
特异性抗体反应后,再
滴加纳米金标记的
第二抗体,结果在
抗原抗体反应处发生金颗粒聚集,形成肉眼可见的红色斑点,此称为斑点
免疫金染色法(Dot-IGS)。此反应可通过银显影液增强,即斑点金银染色法(Dot-IGS/IGSS)。
免疫印迹技术(immunoblotting,IBT)也称为免疫
转印技术,其原理是根据各种抗原分子量大小不同,在电泳中行走的速度不同,因而在
硝酸纤维素膜上占据的位置也不同;把含有特异性抗体的血清和这一薄膜反应,那么特异性的
抗原抗体反应就显色。而纳米金
免疫印迹技术相比
酶标记免疫印迹技术具有简单、快速、具有相当高的灵敏度。而且应用纳米金将硝酸纤维素膜上未
反应抗体进行染色,评估转膜效率,校正抗原一抗体反应的光
密度曲线,即可进行定量免疫印迹测定。
应用于斑点金免疫渗滤测定技术
斑点金免疫渗滤测定法(dot immuno-gold filtration assay,DIGFA)是斑点免疫测定法(dot immunoboding assay,DIBA)中的一种,是1982年由Hawkes等人在
免疫印迹技术基础上改良发展起来的一项免疫学新技术。其原理完全同斑点
免疫金染色法,只是在硝酸纤维膜下垫有
吸水性强的
垫料,即为渗滤装置。在加
抗原(抗体)后,迅速加抗体(抗原),再加金标记第二抗体,由于有渗滤装置,反应很快,在数分钟内即可显出
颜色反应。与斑点免疫渗滤测定法(d o t immunotietration assay,DIFA)相比,所不同的是免加底物液,直接由红色胶体金探针显色,结果鲜艳,背景更清楚,可以在室温下保存。该方法已成功地应用于人的
免疫缺陷病病毒(HI)的检查和人血清中
甲胎蛋白的检测。使用的有HCG试剂盒,
AFP试剂盒,消化道肿瘤筛检试剂盒。
应用于免疫层析技术
免疫层析法(gold immunochromatography assay, GICA)是将各种反应试剂以条带状固定在同一试纸条上,待检标本加在试纸条的一端,将一种试剂溶解后,通过
毛细作用在层析条上
渗滤、移行并与膜上另一种试剂接触,样品中的待测物同层析材料上针对待测物的受体(如抗原或抗体)发生
特异性免疫反应。层析过程中
免疫复合物被截留、聚集在层析材料的一定区域(检测带),通过可目测的纳米金
标记物得到直观的显色结果。而游离标记物则越过检测带,达到与结合标记物自动分离之目的。GICA特点是单一试剂,一步操作,全部试剂可在室温长期保存。这种新的方法将纳米金免疫检测试验推进到~个崭新的阶段。
生物传感器(biosensor)是指能感应(或响应)生物、化学量,并按一定规律将其转换成可用信号(包括
电信号、光信号等)输出的器件或装置。在生物传感器方面,纳米金主要设计为
免疫传感器,是利用生物体内抗原与抗体
专一性结合而导致电
化学变化设计而成。另外由于纳米金的
氧化还原电位是+1.68V,具有夺电子能力,能大大提高作为测定血糖的生物传感器
葡萄糖氧化酶膜的活性,金颗粒越细,活性越大。
生物芯片是以膜、玻璃、硅等固相介质为载体,其最大的优点在于高通量、并行化、微型化。一次实验可同时检测多种或多份
生物样品。生物芯片包括
基因芯片、
蛋白质芯片、
细胞芯片、
组织芯片。生物芯片用于
食品安全检测领域的应用主要包括农药、
兽药残留检测,
食品微生物检测、
动物疫病监测、
转基因动物植物检测等。2002年Park等在《Science》杂志上介绍了一种以纳米金为探针的基于电荷检测的新型基因芯片,该芯片具有非常好的灵敏度及特异性,可以在十万分之一比率中检测出单
碱基突变的
基因片段。
检测应用
食品检测分析一般采用
化学分析法(CA)、
薄层层析法(TLC)、
气相色谱法(
GC)、
高效液相色谱法(HPLC),但需要繁琐、耗时的
前处理,样品损失也较大。相对于灵敏度较低的CA和TLC方法,GC、HPLC的灵敏度较高,但操作
技术要求高、仪器昂贵,并不适合现场快速测定和普及,而以纳米金为免疫标记物的检测技术正弥补了这些技术的缺点,在现代食品分析检测中的运用也越来越多。
兽药残留
所谓兽药残留是指
动物产品的任何
可食部分所含兽药的
母体化合物及,或其
代谢物,以及与兽药有关的杂质的残留。兽药残留既包括原药也包括药物在动物体内的代谢产物。主要的残留兽药有抗生素类、
磺胺药类、
呋喃药类、
抗球虫药、激素药类和驱虫药类。兽药通常是通过在预防和治疗
动物疾病用药、在
饲料添加剂中使用以及在食品保鲜中引入药物而带来对食品的污染。人长期摄入含兽药的
动物性食品后,不但会对人体产生
毒性作用,出现
过敏反应,而且动物体内的
耐药菌株可传播给人体,当人体发生疾病时,就给临床上
感染性疾病的治疗带来一定的困难,延误正常的治疗。另外有些
残留物还具有致畸、致癌、
致突变作用。
Verheijen利用胶体金标记纯化的抗
链霉素单克隆抗体,对链
霉素的
检测限为160ng/ml,检测方便快速,不需要其他试剂和仪器,时间仅需lOmintl41。而使用胶体金免疫层析试纸条,在检测虾肉等组织试样中残留
氯霉素(
chloramphenicol,CAP)残留时,灵敏度可达到 lng/ml,只需5~10min,并且与类似物没有
交叉反应。Yong Jin等也使用
金标法来检测动物血浆和牛奶中的
新霉素残留,其检测限为10ng/mltl6J。
盐酸克伦特罗即β2受体
兴奋剂,俗称“
瘦肉精”能增强
脂解和减慢
蛋白质分解代谢,若在畜牧生产中使用,可明显提高
饲料转化率和
瘦肉率;但使用剂量过大,则会对动物和人(间接)的肝脏、肾脏等器官产生严重的毒副作用。尽管欧盟于1996年禁止在畜牧生产中使用该药(EC Direc. tive 96/22/EC),我国
农业部也于1997年明令禁止,但国内“瘦肉精”中毒事件时有发生。刘见使用金标试纸法快速检测检测盐酸克伦特罗,最小检测量达到40ng/ml。商品化的试纸条产品也比较成熟,
比利时UCB Bio-products公司开发的Tlhe Beta STAR检测法就是将特定的
β-内酰胺受体固定在试纸条上,用胶体金有色微粒作为
标记物,5min内可以检测到
青霉素和
头孢霉素残留。而国内的刘平在用生物电化学传感器检测牛奶中残留的青霉素时,认为使用纳米金将有助于提高传感器的
检测限。
动物传染病
动物传染病不但会影响动物养殖经济,也对人类健康构成威胁,
联合国粮农组织和世界卫生组织已把预防和控制严重的动物
流行病作为其工作重点之一。虾
白斑病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是阻碍虾养殖业发展的主要因素,至今还没有有效的药物,所以及早检测出病毒,显得尤其重要。Wang Xiaojie等已成功研究了斑点免疫金
渗滤法(DIGFA)t19~和金标试纸法来检测虾白斑病毒,其中金标试纸法的
检测限为1 μg/ml,而使用银增强,可以达到0.01μg/ml。赖
清金等使用金标试纸条来检测
猪瘟病毒,10~15min就能检出结果,并可根据检测结果合理指导
猪瘟免疫和建立适宜的
免疫程序。
禽流感病毒(AIV)是引起禽类
急性死亡的烈性、病毒
性传染病,而且能感染人,我国许多地区也先后报道有
高致病性禽流感的发生,给
养禽业造成了重大的经济损失,也严重威胁了人类的健康。刘永德等将兔抗禽流感H5、H9亚型病毒抗体纯化后,分别与制备的胶体金研制成免疫金探针,用改良的渗滤法安全快速地检测被检材料中禽流感H5、H9亚型病毒,3min即可得到结果,
检测灵敏度分别为1.62ug/ml和1.25μg/ml。
农药残留分析的困难包括:样品基质背景复杂、前
处理过程繁琐,需要耗费较多的时间、被测成分浓度较低、分析仪器的定性能力受到限制、仪器检测灵敏度不够等一系列问题,但使用金标记的快速检测可以很好的解决以上问题。国内的王朔分别使用纳米金免疫层析和纳米金渗滤法检测
西维因的残留,整个检测过程只需5min,
检测限也分别达到100ug/L和50μg/L。国内的生物技术公司也开发出了成熟的商品化产品,如
克百威农残速测试纸条等。
基于金标记的快速检测研究在致病微生物方面比较多,检测的种类也比较多。最早Hasan以免疫磁性分离技术为基础的
免疫胶体金技术已成功应用于01群
霍乱弧菌(Vibriocholerae)的检测。国内洪帮兴等人研究了以硝酸纤维膜为载体纳米金显色的
寡核苷酸芯片技术,为在分子水平快速简便的鉴别
致病菌提供了可能,甚至可以检出致病菌的
耐药性变异。该
芯片技术对
大肠埃希氏菌、
沙门氏菌、
志贺氏菌、霍乱弧菌、
副溶血弧菌、
变形杆菌、
单核细胞增生李斯特菌、
蜡样芽孢杆菌、
肉毒梭菌和
空肠弯曲菌等10种(属)具有高灵敏度和
特异性,
检出水平可达10CFU/mlt251。殷涌光等在使用集成化手持式Spreeta TM SPR传感器快速检测
大肠杆菌时,引入胶体金复合抗体作为二次抗体大幅度增加质量,进一步扩大了检测信号,同时延长胶体金复合抗体与微生物的结合过程,使检测信号进一步稳定与放大,从而显著提高了检测精度,使该传感器对大肠杆菌的检测精度由10.6 CFU/ml提高到10.1CFU/ml。金免疫渗滤法重要的食源性致病菌之一大肠埃希氏菌0157:H7,检测通常先以
山梨醇麦康凯琼脂(sMAC)进行初筛,然后用生化和血清学试验做鉴定,一般需要24~48h,而采用胶体金免疫渗滤法检测却非常的简便,在很短时间即可得到结果。
在致病菌快速检测中金标试纸条的研究越来越广泛。谢昭聪等应用胶体金
免疫层析法检测水产品中霍乱弧菌的研究中,增菌液霍乱弧菌含量为1CFU/ml,通过增菌12h后,即可应用胶体金免疫
层析法诊断试剂检出,而一般水产品
霍乱弧菌检测所采用的传统常规方法,检测时限长,增菌培养需8~16h,分离培养需14~20h,初步报告需30h以上,实际操作中,需要3d以上才能出报告。
肠杆菌科的大属沙门氏菌可引起人的沙门氏菌性
食物中毒,王中民等人采用免疫渗滤法可检出85%的引起食物中毒的沙门氏菌,灵敏度为2.4×107CFU/ml,对最常见的鼠
伤寒、
猪霍乱和
肠炎沙门氏菌,
检出率达100%,而采用胶体金免疫层析法的灵敏度为2.1×106CFU/mlt30j。被美国列为七种主要食源性致死病菌之一的
李斯特菌,如果按照传统的
分离培养和鉴定技术需要l~2周时间,而采用
免疫胶体金层析法只需10min就能得到检测结果,灵敏度达到87.5%。
真菌毒素(Mycotoxin)是由真菌(Fungi)产生的具有毒性的二级代谢产物,广泛存在食品和饲料中,人类若误食受污染的食品,就会中毒或诱发一定疾病,甚至
癌症。检测食品中的真菌毒素常用理化方法或
生物学方法。但理化法需要较昂贵的仪器设备,操作复杂。而运用免疫技术检测真菌毒素
敏感性高,特异性强,非常适用于食物样品的检测。D.J.Chiao等使用
金标免疫层析法在10min之内即可检测50ng/ml的肉毒杆菌毒素B(BoNT/B),如果使用银增强则其
检测限可以达到50pg/ml,而且对A、E型
肉毒杆菌毒素没有交叉反应。貉
曲霉毒素是
曲霉属和
青霉属产生的一类真菌毒素,其中毒性最大、与人类健康关系最密切、对农作物的污染最重、分布最广的是
赭曲霉素A(OTA),
赖卫华等研制的
赭曲霉毒素A快速检测胶体金试纸条,检测限达到了10ng/mlt331,远远低于我国对赭曲霉毒素的限量要求5μg/L。
黄曲霉毒素B z的快速检测国内也有很多研究,
孙秀兰研制的黄曲霉毒素B,金标免疫试纸条,其最低
检测限达到2.5ng/ml,而且能定性或
半定量检测食品中的黄曲霉毒素B,含量。
优点
随着科学技术的不断发展,食品分析
检测技术也在不断地更新、完善和迅速发展,尤其是快速检测技术更能适应现代高效、快速的节奏和满足社会的要求。
仪器分析法可以保证数据的
精确性和
准确性,但其流程仍比较烦琐。尽管以纳米金为
标记物的
免疫分析法及其它速测技术的开发过程需投入较多资金和较长时间,但具有简单、快速、灵敏度高、
特异性强、价廉、样品所需量少等优点,其灵敏度与常规的
仪器分析一致,适合现场筛选,而且其中的金免疫
层析技术正在向定量、
半定量检测和多元检测的方向发展,更加体现出金标技术的优势。总之,快速检测技术的快速、灵敏、简便等优点,使之在食品
卫生检疫和环境检测中有着广泛的应用价值和发展前景。
制备方法
配制浓度为2.44×10-3
mol/L 的
HAuCl4·4H2O溶液、浓度为3.43×10-2 mol/L 的Na3C6H5O7·2H2O 溶液、浓度为1.00×10-4 mol/L 的
PVP 溶液, 以及浓度为0.391 mol/L 的
NaBH4 溶液备用。在烧杯中加入10 mL
氯金酸溶液, 10 mL 或不加保护剂溶液, 80 mL
三蒸水, 将烧杯置于数显测速
恒温磁力搅拌器上, 边加热边搅拌, 搅拌的转速设置为600 r/min, 加热至75℃, 恒温2 min, 用
移液管移取一定体积的
还原剂(Na3C6H5O7 或NaBH4)溶液,迅速一次加入到上述
混合液, 开始计时, 使液体颜色恒定并持续加热一段时间共9 min, 停止加热, 继续搅拌5 min 后, 停止搅拌, 冷却至室温, 所得液体为纳米金
溶胶。